MALDI-TOF MS在豬、牛、羊源性成分檢測中的應用

沈麒亮，方志娟，李曉芹，張雪婧，王偉

蘇州市食品檢驗檢測中心（蘇州 215104）

食品摻假作為一種食品欺詐的行為，是影響食品安全的一個重要方面[1-2]。如今豬肉冒充牛肉等現象越來越多，市民對肉類摻假的問題也越來越重視[3-4]。不同肉類具有不同的營養價值和口感，各種肉類之間也存在一定價格差異，肉類摻假往往是商家為謀取更多的利益的一種手段。因此，旨在提出準確有效的方法加強對肉類的摻假鑒別，以維護良好的市場環境[5-7]。

近年來，越來越多的方法被應用于肉類摻假檢測，如聚合酶鏈式反應[8-9]、近紅外光譜[10-12]、酶聯免疫分析法[13]、核磁共振技術[14-15]、電子鼻結合統計學分析技術[16-18]等。這些方法雖然準確可靠，但同時也存在著操作復雜、時間過長、費用昂貴等缺點。基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）作為一門新興技術，適用于測定蛋白質、多肽、脂質等大分子[19-21]。因其前處理簡單、檢測范圍廣等優點，近年來被廣泛應用于微生物、乳制品、水產品、食用油、蜂蜜等各領域[22-27]。試驗采用MALDI-TOF MS技術構建出不同畜肉蛋白質分子指紋圖譜標準數據庫，可對豬、牛、羊3種不同畜肉進行高效鑒別。此次建立的豬、牛、羊源性成分鑒定系統，具有快速、準確、低成本、重復性好的優勢，可被廣泛應用于肉類摻假檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑[融智生物科技（青島）有限公司]；磷酸鹽緩沖液（PBS）。

畜肉樣品（54批次豬、46批次牛、50批次羊，均購自當地超市）

1.2 儀器與設備

QUANTOF 1質譜儀[融智生物科技（青島）有限公司]；AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；BagMixer 400拍打式均質器（法國Interscience公司）；IQ7000超純水機[密理博（中國）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 畜肉樣品蛋白質的提取

稱取25 g樣品（分別為豬肉、牛肉、羊肉），用水清洗后放入無菌袋中，倒入225 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）；在拍打式均質器上以4次/s的速度，均質2 min；將上清倒入50 mL離心管中，于4 ℃冰箱，靜置8 h。從50 mL離心管中取上清，即得肉浸液，可放入-80 ℃冰箱備用。取2 μL肉浸液，加18 μL SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑，混勻，滴加2 μL于靶點正中，干燥，待上機檢測。

1.3.2 質譜數據的采集

將制備好的樣品靶通過檢測口放入質譜儀內部托盤并固定。啟動激光系統提供脈沖激光，打擊樣品靶點，在質荷比2 000～35 000范圍內掃描和采集數據。采用儀器自帶分析軟件對質譜圖進行平滑、對齊、歸一化等處理。

1.3.3 化學計量學分析

將采集到的150組MALDI-TOFMS數據導入Chem Pattern化學計量學軟件[科邁恩（北京）科技有限公司]，篩選獲得共有模式，對豬、牛、羊3種畜肉的差異性進行多元統計分析。

2 結果與分析

2.1 豬、牛、羊動物源性成分指紋圖譜的建立

對150批次3種不同類型的畜肉進行測定，采集MALDI-TOF MS譜圖并進行平滑、對齊、歸一化等處理，豬、牛、羊3種不同類型畜肉質譜圖如圖1所示。

圖1 3種不同類型畜肉質譜圖

2.2 指紋圖譜相似度分析

將質譜數據導入Chem Pattern軟件進行分析，樣品圖譜經去背景、平滑等規范化前處理，以保留時間對樣品圖譜進行校正。采用歐氏距離算法分析相似度，可以看出豬、牛、羊3種不同類型畜肉能夠歸屬到各自類別，同一類型產品距離共有模式的距離相當，分離效果較好（圖2）。

圖2 相似度評價結果

2.3 指紋圖譜多元統計分析

多元統計分析方法常用的有系統聚類分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析、自組織映射人工神經網絡等[28]。系統聚類分析是將一些相似度較高的樣品先聚合為一類，根據相似程度將不同類的樣品不斷聚合成一個更大的類，直到所有的樣品都聚合完畢，從而形成一張完整的系統聚類圖，能準確反映各類之間的親疏關系[29]。主成分分析是依據降維思想，損失較少原始信息，直接把多個指標轉化為幾個綜合指標的一種多元統計方法[30]。偏最小二乘判別分析是偏最小二乘回歸的一種特殊形式，是對多元線性回歸模型的拓展分析。自組織映射人工神經網絡適用于復雜體系數據的可視化、降維、模式識別以及數據挖掘，它能夠將任意維數的原始數據在保持拓撲結構不變的情況下映射到二維空間內。

豬、牛、羊3種不同類型畜肉的系統聚類分析如圖3所示。按照不同對象之間差異，利用歐式距離函數作模式進行分類，圖3（B）中的顏色代表歸一化法下各個峰所占的面積百分比。系統聚類分析結果顯示，3種不同類型畜肉都能被很好地區分開。該分析方法可直觀觀察每個樣品中的共有峰在樣本和自變量2個維度中所形成的聚類模式及其對聚類結果的影響，能夠清楚地反映樣本之間的親疏關系。

圖3 聚類分析結果

主成分分析及偏最小二乘回歸分析如圖4和圖5所示。3種不同類型畜肉能很好地被分開，很少有樣品出現偏離現象，2種不同的分析方法結果完全相同。圖6自組織映射神經網絡分析顯示的樣品位置情況更為直觀，樣品分類結果與圖4、圖5這2種分析方法結果完全一致。

圖4 主成分分析圖譜

圖5 偏最小二乘回歸分析圖譜

圖6 自組織映射神經網絡圖譜

2.4 化學模式識別

將9批次牛肉樣品作為測試集，采用PLS-DA算法進行模式識別，測試結果如表1和圖7所示。可以看出，牛肉樣品全部被正確識別，誤識率為0，識別率為100%。因此，所建立的模型能夠提供一個穩定的評價標準，準確判定所選畜肉的類型。

表1 模式識別結果統計

圖7 PLS-DA模型分類預測效果圖

3 結論

利用MALDI-TOF MS技術分析豬、牛、羊3種不同畜肉的蛋白質譜圖，建立不同畜肉蛋白質分子指紋圖譜標準數據庫。配合Chem Pattern先進化學計量學分析，建立基于蛋白質組學的成分鑒定系統，為豬、牛、羊3種不同畜肉動物源性成分的鑒別提供新思路。