UPLC-MS/MS法測定雞肉中5種硝基呋喃代謝物

李招，李劍，徐巧

杭州譜育科技發展有限公司（杭州 311300）

硝基呋喃是一類合成的廣譜抗菌和抗寄生蟲藥物[1-3]，能有效抑制革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等的代謝和生長[4-6]，因其顯著的抗菌功效而作為飼料添加劑被廣泛用于畜牧業[4]。在獸醫實踐中，硝基呋喃類藥物可用于預防和治療家畜、魚類、蜂蜜等的細菌感染，抑制水產養殖中細菌的生長[7]。但毒理學研究表明，硝基呋喃母體化合物及其代謝產物具有致癌、致畸和致突變的風險，許多國家禁止在獸藥中使用硝基呋喃類藥物[8-9]。歐盟早在2003年將動物源食品中硝基呋喃類代謝物的最低要求性能水平定為1 μg/kg[10]，2022年10月27日我國海關總署發布緊急公函把硝呋索爾代謝物（DNSA）納入5種必檢硝基呋喃代謝物中。硝基呋喃類藥物在動物體內可快速分解，難以檢測，但其代謝物能與蛋白高度穩定結合[11-12]。硝基呋喃類代謝物分子量低、電離性能差和極性高，需要通過衍生反應增加分子量，提高檢測靈敏度[13]。

硝基呋喃類代謝物的檢測方法主要有酶聯免疫法（ELISA）[14-15]，高效液相色譜法（HPLC）[16-17]和高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[18-19]。酶聯免疫法存在假陽性概率[20]，高效液相色譜法選擇性差，靈敏度低，且無法提供物質結構或組成的有效信息[21-22]。高效液相色譜串聯質譜法靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強，是測定硝基呋喃代謝物最有效的方法[23-25]。

在GB 31656.13—2021《食品安全國家標準 水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留測定》的基礎上，在酸性條件下超聲輔助衍生，優化液液萃取條件，選擇甲醇水體系流動相，建立超高效液相色譜串聯質譜法快速測定雞肉中1-氨基-2-內酰脲（AHD）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）和3,5-二硝基水楊酸肼（DNSA）5種硝基呋喃代謝物殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與儀器

1-氨基-2-內酰脲（AHD）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）及同位素內標AHD-13C3、AOZ-D4、SEM·HCl-13C，15N2、AMOZ-D5（含量均≥99.0%，上海安譜公司）；3,5-二硝基水楊酸肼（DNSA，純度≥99.0%，天津阿爾塔公司）。

甲醇（色譜純，Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，Honeywell公司）；乙酸銨（色譜純，Aladdin公司）；鹽酸、無水磷酸氫二鉀（均為分析純）；2-硝基苯甲醛（純度≥98.0%，上海安譜公司）、二甲基亞砜（色譜純，Aladdin公司）；試驗用水均為超純水。

雞肉購自市場，取可食用部分攪碎，冷藏待用。

1.1.2 儀器與設備

數據收集。本研究計劃訪談23家酒店，但由于各種原因，23家酒店中有9家表示無法安排面對面的采訪。其主要理由包括：忙于營銷活動而沒有時間接受訪談；剛剛開業不久仍在制定他們的社交媒體營銷計劃；社交媒體營銷計劃受集團總部控制，且負責人不在海南；沒有專門的社交媒體營銷部門等等。另有3酒店開始愿意接受訪談，但在看完所問問題后拒絕了采訪。最終實際采訪的酒店數量為11家。

超高效液相色譜儀（ULC 510，杭州譜育科技發展有限公司）；三重四極桿串聯質譜儀（配電噴霧離子源ESI，EXPEC 5210，杭州譜育科技發展有限公司）；數控超聲清洗儀（KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器（NMSG-12，泰州諾米醫療科技有限公司）；氮氣濃縮儀（EFAA-DC24-RT，上海安譜公司）；分析天平（BSA124S，德國Sartorius公司）；高速冷凍離心機（TGL-16M，湖南湘儀公司）；Milli-Q超純水機（Direct-Q 3UV，美國Millipore公司）；高剪切分散乳化機（FA25D，上海弗魯克公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別準確稱取10.0 mg硝基呋喃類代謝物標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度1.0 mg/mL的標準儲備液。

分別準確量取適量標準儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制成質量濃度100 μg/L和10 μg/L的混合標準工作液。

分別準確稱取適量的硝基呋喃類代謝物內標標準品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度1.0 mg/mL的內標標準儲備液。

分別準確量取適量內標標準儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制成質量濃度100 μg/L的混合內標標準工作液。

稱取2 g空白基質樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇水溶液均質離心棄去上清液，分別準確加入混合標準工作液及內標工作液，按照前處理步驟處理，使最終質量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 μg/L，內標質量濃度5.0 μg/L，按分析方法測試，繪制標準曲線，求線性回歸方程及相關系數。

取2 g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇水溶液均質離心并棄去上清液。離心管中加入適量內標工作液，渦旋混勻，加5 mL 0.5 mol/L的鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L的2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩，置于超聲儀中超聲處理。

取出離心管冷卻，用1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液調節pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，振蕩均勻，冷凍離心后快速移取上清液，于40 ℃氮氣吹干。加5%甲醇溶解殘余物并定容至1.0 mL，將溶液轉移至1.5 mL離心管中，冷凍離心后溶液過微孔濾膜，待上機定量分析。

1.3 分析方法

色譜柱CNW C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進樣體積10 μL，流動相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇。梯度洗脫：0～0.5 min，A保持90%，0.5～4 min，A由90%變為5%，4～5 min，A保持5%，5～5.5 min，A由5%變為90%，并保持2 min。

電噴霧離子源（ESI）正負離子切換模式，ESI+電離電壓5.0 kV，ESI-電離電壓4.2 kV，去溶劑氣溫度480 ℃，霧化氣流量1.2 mL/min，多反應監測模式（MRM），監測離子參數見表1。

表1 硝基呋喃代謝物及同位素內標質譜參數

2 結果與分析

2.1 流動相體系選擇

流動相直接影響目標化合物的峰形及離子化效率，液質常用甲醇水體系和乙腈水體系流動相。流動相中加入甲酸可提高正離子模式的離子化效率，但會抑制負離子的響應，加入乙酸銨調節流動相pH，改善色譜峰形，增強化合物在C18色譜柱上的保留。采用CNW C18色譜柱考察目標化合物在2種流動相體系下的分離情況。梯度洗脫條件下，甲醇水體系作為流動相時，5種硝基呋喃代謝物及內標的分離效果和響應更好，添加2 mmol/L乙酸銨改善峰形。使用乙酸銨溶液（2 mmol/L）和甲醇為流動相測得5種硝基呋喃代謝物的色譜圖如圖1所示。

圖1 乙酸銨溶液（2 mmol/L）和甲醇流動相測得硝基呋喃代謝物色譜圖

2.2 前處理方法優化

2.2.1 超聲溫度優化

空白雞肉試樣中加入混合標準工作液，添加濃度1.0 μg/kg，按照1.2.2處理樣品，水浴溫度分別設為40，50，55，60和70 ℃，衍生時間設定為80 min。超聲溫度從40 ℃升高到60 ℃時，隨衍生反應溫度升高，5種硝基呋喃代謝物的回收率增加；衍生溫度超過60 ℃時，回收率升高不明顯?？紤]到溫度對衍生產物的影響，選取60 ℃為超聲輔助衍生的反應溫度。5種硝基呋喃代謝物在不同超聲溫度下的回收率如圖2所示。

圖2 超聲溫度對5種硝基呋喃代謝物回收率的影響

2.2.2 超聲時間優化

空白雞肉試樣中加入混合標準工作液，添加質量分數1.0 μg/kg，按照1.2.2處理樣品，超聲時間分別設為30，60，80，100，120和140 min，衍生溫度設定為60 ℃。超聲時間30～80 min時，隨著衍生反應時間增加，5種硝基呋喃代謝物的回收率逐漸升高。超聲時間80～120 min時，2-NP-AHD、2-NP-AOZ和2-NPSEM的回收率升高緩慢，而2-NP-AMOZ和2-NP-DNSA的回收率降低。超聲時間超過120 min后，5種硝基呋喃代謝物的回收率降低。超聲輔助有助于硝基呋喃代謝物從蛋白中解離，有利于衍生反應，但超聲時間過長會導致衍生產物分解，故選取80 min為超聲輔助衍生的反應時間。5種硝基呋喃代謝物在不同超聲時間下的回收率如圖3所示。

圖3 超聲時間對5種硝基呋喃代謝物回收率的影響

2.2.3 萃取條件優化

空白雞肉試樣中加入混合標準工作液，添加濃度1.0 μg/kg，按照1.2.2處理樣品，加入乙酸乙酯萃取后，選擇常溫離心、冷凍離心及乙酸乙酯多次提取等方式優化萃取條件。常溫離心后，移取上清液時會帶入少量油脂；冷凍離心時，動物油脂會成團附著在離心管壁，易得到純凈的上清液。乙酸乙酯多次提取，能提高硝基呋喃代謝物回收率。比較常溫離心、冷凍離心及冷凍離心和多次萃取等方法得到5種硝基呋喃類代謝物回收率，如圖4所示，通過冷凍離心和乙酸乙酯多次萃取能獲得較高的回收率。

圖4 萃取條件對5種硝基呋喃代謝物回收率的影響

2.3 基質效應

液質測定基質樣品時，樣品中的共流出物影響目標化合物離子化，從而影響檢測的選擇性、靈敏度和重復性，這種現象基質效應?；|效應（ME）可通過化合物在空白基質中標準曲線斜率和基質溶液中標準曲線斜率的相對比值評價。在實際樣品測試中，ME相對比值在80%～120%時，表明基質效應不明顯；ME相對比值小于80%或大于120%時，表明基質抑制或基質增強。

結果表明，雞肉試樣中5種硝基呋喃代謝物的基質效應計算結果在80%～120%范圍內，表明基質效應不明顯。

表2 雞肉試樣中5種硝基呋喃代謝物的基質效應

2.4 線性關系、檢出限和定量限

空白雞肉試樣中加入混合標準工作液配制基質標準曲線，在線性范圍（0.5～20.0 μg/L）內，線性關系良好（r≥0.998 5）。以大于3倍信噪比（rSN，峰-峰）為檢出限，大于10倍信噪比（rSN，峰-峰）為定量限。線性回歸方程、線性相關系數、檢出限和定量限見表3。

表3 雞肉試樣中硝基呋喃代謝物的線性關系和檢出限

結果表明，5種硝基呋喃代謝物的標準曲線的線性相關系數r≥0.998 5，檢出限在0.02～0.06 μg/kg范圍內，定量限在0.05～0.21 μg/kg范圍內，優于GB 31656.13—2021要求。

2.5 回收率和精密度

空白雞肉試樣中加入混合標準工作液，添加質量分數分別為0.5，1.0，2.5和5.0 μg/kg，在4個加標水平下進行6次試驗，考察方法回收率和精密度。結果表明，在0.5，1.0，2.5和5.0 μg/kg加標水平下的平均回收率在72.0%～100.8%之間，相對標準偏差（SRSD）在2.2%～6.2%（n=6），符合GB 31656.13—2021要求。4個加標水平下的回收率和精密度試驗結果見表4。

表4 雞肉試樣中硝基呋喃代謝物回收率和精密度結果（n=6）

3 結論

通過對檢測方法和前處理方法進行優化，建立超聲輔助衍生-超高效液相色譜串聯質譜法測定雞肉中5種硝基呋喃代謝物殘留量的分析方法，并驗證標準曲線線性范圍、檢出限、定量限、回收率及精密度等方法學指標。該方法快速簡便，靈敏度高，重復性好，方法學性能指標滿足GB 31656.13—2021要求，適用于雞肉中硝基呋喃代謝物的檢測分析，并為其快速抽檢和硝基呋喃類獸藥監測提供參考。