生牛乳中β-內酰胺酶檢測杯碟法的優化

陸雯，俞琦婭，朱晗昀，童曉玲，李秀通，王珍

綠城農科檢測技術有限公司（杭州 310000）

青霉素對奶牛的乳腺炎及一些細菌性感染有很好的治療效果[1]，且價格低廉、便于獲取，被廣泛應用于畜牧生產中。但青霉素頻繁的超劑量使用會使牛奶中含有高濃度的殘留物，長期食用抗奶會對人體帶來不同程度的危害[1-2]。β-內酰胺酶是一種抗生素分解劑，能將牛乳中抗生素殘留量降到限量標準，為謀取經濟利益，一些不良商販利用此原理在生鮮牛乳中違法添加β-內酰胺酶，從而得到“無抗奶”，更滋生出抗生素濫用的現象，因此牛乳中有β-內酰胺酶的殘留[3]。國內外對生牛乳的β-內酰胺酶檢測主要有高效液相色譜法、碘量法和杯碟法[4-7]。高效液相色譜法操作復雜，檢測成本高[6]。碘量法靈敏度差且不同樣本重復性差[7]。杯碟法靈敏度高，易操作，易判定[9-13]。但該方法不能排除非人為添加的可能性。奶牛體內的致病菌產生耐藥性后自身代謝產生β-內酰胺酶。有研究證明革蘭陽性菌只產生青霉素酶和頭孢菌素酶這兩種β-內酰胺酶，外源添加的β-內酰胺酶主要是青霉素酶[14]。革蘭陰性菌可產生的β-內酰胺酶種類繁瑣，已發現有2 000余種，被認為是內源性β-內酰胺酶[15]，且內源性β-內酰胺酶能被檢出。其來源應該有2種途徑：一是牛體本身產生；二是牛體本身感染某些有抗性的微生物，而這些微生物在體內不斷表達分泌β-內酰胺酶類，致使生鮮牛乳檢測呈陽性。為排除非人為添加導致牛乳中β-內酰胺酶的不合格、提高檢測準確性，在SN/T 3979—2014《乳及乳制品中β-內酰胺酶的測定方法杯碟法》和NY/T 3313—2018《生乳中β-內酰胺酶的測定》中杯碟法的基礎上，通過增加內源性β-內酰胺酶的檢測，即同步增菌培養，利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）顯色反應[16]及培養前后對照試驗，排除內源性β-內酰胺酶的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

藤黃微球菌[Micrococcus luteusCICC（B）28001，中國工業微生物菌種保藏管理中心提供]。

樣品：鮮牛乳樣品100份、人工添加β-內酰胺酶標準品的滅菌脫脂牛乳50份和無任何添加滅菌脫脂牛乳50份。

標準品：青霉素G、β-內酰胺酶標準品（4 000 000 U/mL）、舒巴坦，均購自中國藥品生物制品檢定所。

培養基：營養瓊脂培養基、抗生素檢測用培養基Ⅱ（pH 6.5±0.1），均購自青島海博生物技術有限公司。

生化培養箱（LRH-250F，上海一恒科學儀器有限公司）；精密移液器（Research plus，德國艾本德股份公司）；游標卡尺（Ⅰ型，桂林五順量具制造有限公司）。

1.2 方法

將樣品平均分成4份，第1份在冷藏保存24 h內進行測定，其余每隔24 h測定1次，共測定3次。同時每隔12 h進行1次菌落總數的測定，以觀察牛乳中微生物的變化。

1.2.1 檢驗用板的制備

將藤黃微球菌制成菌懸液，按照適當比例加入滅菌后冷卻至46±1 ℃的抗生素檢定培養基Ⅱ中，充分搖勻后制備菌體數量約1×108CFU/mL的含菌培養基；取15～20 mL含菌培養基倒入無菌培養皿，凝固后備用。

1.2.2 試樣的測定

各取1.00 mL充分混勻的生牛乳于4個1.5 mL離心管，分別標為A、B、C、D，每個稀釋品平行試驗2個，同時用滅菌水作為空白試驗，按照表1依次分別加入β-內酰胺酶標準溶液（4 000 U/mL）、舒巴坦標準溶液、青霉素標準溶液。混勻后，取A～D試樣各200 μL分別加入到放置于檢驗用平板上的4個牛津杯中，平板加蓋后放入37±1 ℃生化培養箱中培養18～22 h。測量各抑菌直徑，取2個平行測定結果的平均值。

表1 試樣的添加 單位：μL

1.2.3 內源性β-內酰胺酶測定

1.2.3.1 內源性β-內酰胺酶測定前的培養

各取1環生牛乳試樣接種于已滅菌的脫脂奶粉中于37±1 ℃生化培養箱中，設置5組每組3平行，培養24 h。同時設置無接種的滅菌脫脂乳作為對照。

1.2.3.2 TTC濃度的選擇

在經過1.2.3.1培養的試液中每組分別添加濃度0，0.01，0.05和0.10 mol/L TTC，每個濃度添加3支，于37℃恒溫水浴中孵育2 h，觀察顏色變化。

1.2.3.3 杯碟法測試

將初測陽性的牛乳樣品經過接種培養后按照1.2.2步驟進行操作，分別測定抑菌圈直徑大小。以滅菌脫脂乳作為陰性對照，未經處理的原牛乳樣品作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 不同時間冷藏后的檢測結果

測定的100份樣本中，在48 h內檢測的結果均為陰性，而72 h有2批樣品出現陽性結果，結果見表2，同時觀察陽性批次對應的菌落生長情況，結果見圖1。試驗結果表明，部分牛乳中可能含有產生內源性β-內酰胺酶產生的微生物。

圖1 不同冷藏時間的生牛乳中微生物的生長情況

表2 不同冷藏時間的檢測結果

表3 不同TTC濃度顯色情況

2.2 TTC濃度的選擇

在2.1中檢出的陽性樣品，經1.2.3.1操作培養24 h后，添加不同濃度的TTC試液并于37 ℃水浴孵育2 h后發現，終濃度0.000 5%～0.001 0% TTC的試液顏色紅色不明顯，0.002 0%粉色明顯，因TTC有一定毒性，故在保證結果可辨的情況下選擇終濃度為0.002 0%的TTC作為最終試驗濃度。

2.3 生鮮乳中內源性β-內酰胺酶的測定結果確認

取冷藏72 h的樣品，分別按1.2.2和1.2.3步驟進行測定，結果見表4。結果表明，測定的100份樣本中，有2份出現陽性結果。2份初測陽性樣品經1.2.3.1步驟測試發現有2份樣品中TTC變紅，證明有內源性β-內酰胺酶的存在。結合TTC檢測結果，可最終確認外源性β-內酰胺酶檢出批次為0份。

表4 2種方法檢測生鮮乳中β-內酰胺酶的檢出情況

2.4 人工制備的滅菌脫脂乳中β-內酰胺酶的測定結果

對50份添加β-內酰胺酶大于方法檢出限的滅菌脫脂乳和50份未添加抗生素的滅菌脫脂乳分別按1.2.2和1.2.3步驟進行測定，結果見表5。結果表明，TTC無法測定外源性添加的β-內酰胺酶，杯碟法測定的結果與實際一致。

表5 2種方法檢測人工制備的滅菌脫脂乳中β-內酰胺酶的檢出情況

3 討論

對于出現陽性的2份樣品，經內源性β-內酰胺酶測定處理后的樣品與未處理前的樣品同時用杯碟法步驟進行操作測定，均出現陽性結果。結果表明，樣品中存在分泌內源性β-內酰胺酶的細菌，經過培養后因菌體大量繁殖導致分泌的β-內酰胺酶量達到杯碟法的檢出限而被檢出。而對于人工添加β-內酰胺酶的樣本，TTC檢測法無法檢出，可排除樣本中內源性β-內酰胺酶活性微生物的存在或未達到檢出的閾值。

在已有β-內酰胺酶杯碟法檢測基礎上，增加TTC檢測法在一定程度上可對可疑陽性樣品進一步篩查排除內源性β-內酰胺酶的干擾，提高檢測結果的可靠性。因TTC法只能檢測活菌，無法排除本身已產生β-內酰胺酶而無活菌的樣品，對于此，試驗結果可為后期進一步研究提供方向。

4 結論

在β-內酰胺酶杯碟法的基礎上增加檢測牛乳內源性β-內酰胺酶方法，可排除內源性β-內酰胺酶的干擾，提高檢測結果的可靠性。