疏水殼聚糖氣凝膠的制備和負載姜黃素及緩釋性能

許丁予，焦思宇，姚先超，劉 鑫，陳麗芬，林日輝*

（廣西民族大學化學化工學院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，林產化學與工程國家民委重點實驗室，廣西林產化學與工程重點實驗室/協同創新中心，廣西 南寧 530006）

姜黃素來源于一些姜科、天南星科植物，其本身具有良好的緩解炎癥和抗腫瘤等特性[1]。早在1870年，姜黃素從姜黃（Curcuma longaL.）中首次分離出來[2]。姜黃素為橙黃色結晶粉末，味苦，水溶性較差，溶于乙醇。齊莉莉等[3]研究表明，姜黃素單體在pH 2～4的酸性環境下不穩定，而口服姜黃素是常見的用藥方式之一，這導致姜黃素在腸胃內吸收利用的效率受限于其自身的穩定性。因此需要制備新型藥物載體提高藥物的利用率。目前負載姜黃素的新型載體主要有蛋白質或者低聚糖復合納米顆粒、脂質體和水凝膠等材料，受限于原材料的反應位點，其制備過程較為繁瑣。

殼聚糖是一種來源于海洋的天然生物多糖[4]，它是甲殼素脫乙酰化后的產物。殼聚糖自身安全無毒，具有良好的生物降解性、生物相容性。同時還有抑菌、抗癌、降脂、增強免疫等多種生理功能，廣泛應用于食品添加劑[5]、人造組織材料[6]、藥物緩釋材料[7]、基因轉導載體[8]以及藥物開發等各種領域。關于殼聚糖的研究多種多樣，其中將殼聚糖作為基質制備藥物載體一直以來都是研究熱點。例如，Shen等[9]設計了一種三聚磷酸鹽-殼聚糖交聯四環素海綿，用于四環素的緩釋；Alagha等[10]開發了多孔黏膜黏附生物海綿作為釋放地塞米松的載體，用于治療口腔黏膜炎。

由于殼聚糖自身的胺基基團較為活潑，在酸性條件下殼聚糖胺基發生質子化，從而攜帶正電荷，再利用三聚磷酸鹽的靜電交聯作用制備得到輕質氣凝膠。但殼聚糖氣凝膠表面光滑，容易破碎，親水性強[11]。因此為了開發一種安全的脂溶性藥物載體，對殼聚糖氣凝膠進行疏水改性。在現有的氣凝膠疏水改性研究中，Ganonyan等[12]采用三甲基氯硅烷作為交聯改性劑，使氣凝膠具備了超疏水性能，表面水滴接觸角測試達到150°。但多數研究所采用的交聯改性劑大多為有毒的有機試劑，不利于作為藥物載體。因此本研究從食品添加劑中得到了啟發，使用甜瓜醛作為交聯改性劑。

甜瓜醛作為一種常見的食品用香料，常溫下呈無色透明液體，能提供一種強烈的綠色甜瓜和黃瓜香氣，可添加于任何類型的香精配方中。因為其具備鏈式的分子結構，同時分子末端還存在一碳碳雙鍵。若在殼聚糖分子間插入，不僅利于交聯反應[13]，而且還能接枝額外基團，以改善其理化性能。

本研究以殼聚糖為基質，加入三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）作為離子交聯劑，采用離子交聯法[14]制備了TPP交聯殼聚糖氣凝膠（tripolyphosphate chitosan，TCS）。再通過甜瓜醛和正十八硫醇對殼聚糖氣凝膠進行交聯和改性，制備得到疏水殼聚糖氣凝膠（octadecyl mercaptan melonal tripolyphosphate chitosan，OMTCS）。并對脂溶性藥物姜黃素進行負載和體外模擬緩釋研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（分析純，脫乙酰度≥95%）、甜瓜醛（色譜純）、正十八硫醇（97%）、TPP（分析純）、姜黃素（98%）上海麥克林生化有限公司；胃蛋白酶（1∶10 000）、胰蛋白酶（1∶2 5 0） 北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（分析純） 成都科隆化學品有限公司；冰乙酸（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；JY92-IIN超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-1A-50＋冷凍干燥機 博醫康儀器有限公司；MQL-61R立式振蕩培養箱 上海旻泉儀器有限公司；UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司；SUPRA55 Sapphire場發射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；MAGNA-1R 550傅里葉變換紅外光譜儀、K-Alpha X射線光電子能譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；MiniFlex600 X射線衍射儀 日本理學公司；NETZSCH STA2500熱重分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司；SDS-350接觸角測量儀 東莞市晟鼎精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TCS的制備

取1.2 g殼聚糖溶解在60 mL 1%的冰醋酸溶液中，置于恒溫水浴鍋中加熱1 h，待溶解完全后逐滴加入6 mL的5 mg/mL TPP溶液[15]，然后超聲分散溶液10～15 min。靜置溶液，待其冷卻后置于-30 ℃冰柜中冷凍24 h，并在冷凍干燥機中冷凍干燥72 h后取出。制備得到白色的殼聚糖氣凝膠。

1.3.2 甜瓜醛交聯殼聚糖氣凝膠（m e l o n a l tripolyphosphate chitosan，MTCS）的制備

配制400 mL，1%的甜瓜醛乙醇溶液，將TCS置于溶液中70 ℃反應6 h。反應完成后室溫下干燥。得到具有甜瓜香味的殼聚糖氣凝膠。

1.3.3 OMTCS的制備

參考Su Chunping等[15]的方法，配制300～400 mL，10 mmol/L的正十八硫醇乙醇溶液，將MTCS置于溶液中反應30 min，反應完成后用無水乙醇洗滌3 次，在烘箱中60 ℃烘干得到柔軟的OMTCS。

1.3.4 樣品表征

除用于掃描電子顯微鏡的樣品外，其余樣品用液氮冷凍后粉碎處理。

場發射掃描電子顯微鏡掃描：從OMTCS表面取下小塊黏在導電膠片上，然后將導電膠片粘貼于樣品臺上并用真空鍍膜儀噴鍍鉑金層，制得樣品。在掃描電子顯微鏡下觀測OMTCS的表面構造，采用SE2探測器，工作距離為5.9 mm，加速電壓為1.5 kV。

傅里葉變換紅外光譜分析：采用KBr壓片法制備樣品，首先將KBr粉末和樣品粉末干燥，然后以樣品與KBr質量比為1∶50置于瑪瑙研缽中充分研磨，轉移到模具中在壓機上壓成半透明薄片。用傅里葉變換紅外光譜儀測試分析，背景和樣品掃描次數同為32，掃描波數范圍400～4 000 cm-1，動鏡速率0.632 9 mm/s。

X射線光電子能譜掃描：取適量樣品粉末壓片后，貼于樣品盤上，將樣品放進X射線光電子能譜儀器樣品室中。使用Al Kα射線（hv=1 486.68 eV）激發樣品表面發射光電子，利用能量分析器測量光電子動能，進而得到激發電子的結合能。工作電壓12 kV，工作電流6 mA。全譜掃描下，10 次循環信號累加，通能為150 eV，步長1 eV；窄譜掃描下，5 次循環信號累加，通能為50 eV，步長0.1 eV。

X射線衍射儀分析：將樣品粉末放置在玻璃樣品槽上輕壓至平整，將樣品槽轉移到樣品箱中測試分析，掃描范圍2θ設為5°～80°，步寬為0.02°，掃描速率為8 °/min，電壓和電流分別設為40 kV和15 mA。

熱重分析儀分析：將樣品粉末置于熱重分析儀天平室中，在N2氣氛下進行測試。升溫區間為30～800 ℃，升溫速率20 K/min。

接觸角測量儀測試：平整取出小塊OMTCS樣品，穩定放置在載玻片上，在采樣時間10 ms、總數200幀下，對其分別進行表面接觸油滴和水滴測試。接觸角使用采樣軟件進行計算。

1.3.5 標準曲線的繪制

1.3.5.1 姜黃素在無水乙醇中的標準曲線

參考高鳳苑等[16]的方法，準確稱取125 mg姜黃素粉末，加入到盛有100 mL無水乙醇的燒杯中超聲振蕩溶解。將溶液轉移至250 mL容量瓶中定容后得到質量濃度為500 mg/L的姜黃素-乙醇溶液，避光儲存。將制備好的姜黃素-乙醇溶液分別稀釋到0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5 mg/L五個質量濃度梯度，用紫外分光光度計在姜黃素最大吸收波長425 nm處測得其吸光度。以姜黃素含量（mg/g）為橫坐標（x），以吸光度為縱坐標y，繪制得到姜黃素的標準曲線為y=0.153x-0.001 8，R2=0.999 8。

1.3.5.2 姜黃素在胃液中的標準曲線

根據《中國藥典》[17]配制pH 1.6的胃液，以胃液為溶劑配制得到1、2、3、4、5 mg/L五個質量濃度梯度的姜黃素胃溶液。在紫外分光光度計下進行光譜掃描，發現其最大吸收波長為430 nm，然后在波長430 nm處分別測得其吸光度。以姜黃素含量（mg/g）為橫坐標（x），以吸光度為縱坐標（y），繪制得到姜黃素的標準曲線為y=0.040 9x＋0.002 9，R2=0.999。

1.3.5.3 姜黃素在腸液中的標準曲線

根據《中國藥典》配制pH 6.8的腸液，方法同1.3.5.2節，測得姜黃素腸溶液最大吸收波長為371.5 nm。繪制得到姜黃素的標準曲線為y=0.032 9x＋0.002 6，R2=0.999 1。

1.3.6 OMTCS負載姜黃素測試

配制500 mg/L的姜黃素-乙醇溶液。取數個25 mL錐形瓶，加入20 mL配制好的姜黃素-乙醇溶液和30 mg的OMTCS，放置在立式振蕩培養箱中。分別設置17、27、37 ℃三個溫度梯度進行負載測試。取樣時間點為20、40、60、100、1 440 min，每次取樣100 μL。稀釋100 倍后，利用紫外分光光度計在姜黃素最大吸收波長425 nm處測其吸光度。負載量按式（1）計算：

式中：q為藥物負載量/（mg/g）；C1為吸附前姜黃素的質量濃度/（mg/mL）；C2為吸附后姜黃素的質量濃度/（mg/mL）；V為吸附的溶液體積/mL；m為吸附材料OMTCS的用量/mg。

1.3.7 姜黃素的體外模擬緩釋實驗

緩釋實驗以《中國藥典》中“緩釋、控釋和遲釋制劑指導原則”為依據。取250 mL燒杯，分別加入100 mL的模擬胃液和模擬腸液，同時加入10 mg的OMTCS-姜黃素（載藥量為51.5 mg/g）。將燒杯放置在立式振蕩培養箱中固定，轉速設為160 r/min，溫度設為37 ℃，模擬體外緩釋。取樣時間點為10、30、60、100、150、240、420、690、1 050、1 440 min。每次取樣5 mL，樣品溶液用有機膜過濾后在紫外分光光度計下檢測其吸光度。累計緩釋率按式（2）計算：

式中：Mt為藥物累計緩釋率/%；Ci為第i次置換時釋放液中的姜黃素質量濃度/（mg/mL）；D為藥物的負載量/（mg/g）；m為載藥后材料的質量/g；n為介質的置換次數；Ve為釋放介質置換體積/mL；V0為起始釋放液體積/mL。

1.3.8 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）抗氧化性實驗

DPPH是一種很穩定的氮中心的自由基，當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數量呈定量關系[18]。參考焦思宇等[19]的方法，首先配制50 μg/L的DPPH自由基溶液，取數個10 mL離心管，實驗組時間梯度設為10、20、40、60、120、720、1 440、2 880 min，分別加入10 mL的DPPH自由基溶液和10 mg的OMTCS-姜黃素（載藥量為66 mg/g）。對照組加入0.66 mg的姜黃素粉末，時間梯度設為10、20、40、60、120 min。反應完成時，及時取出上清液，使用紫外分光光度計在DPPH最大吸收波長515 nm處測得其吸光度。DPPH自由基清除率按式（3）計算：

式中：D為DPPH自由基清除率/%；A0為DPPH自由基初始溶液的吸光度；A1為加入載藥材料后DPPH自由基溶液的吸光度；AD為載藥材料在同體積無水乙醇中的吸光度。

1.4 數據處理

所有實驗均設有3 組平行實驗組，使用WPS Office軟件進行實驗數據統計，使用Origin 2018軟件對實驗數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡分析

如圖1所示，OMTCS表面呈現出三維多孔結構，孔道分布深，其內壁多層疏松。此結構歸功于甜瓜醛與殼聚糖的交聯反應，使OMTCS分子間不僅存在TPP與殼聚糖的靜電作用力，還有新共價鍵的生成，而硫醇的加入使共價鍵進一步飽和。讓OMTCS自身超輕質量的同時還具有良好的機械強度，經過多次擠壓還能夠恢復形貌。

圖1 OMTCS表面掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of OMTCS surface

2.2 傅里葉變換紅外光譜儀分析

如圖2 所示，甜瓜醛紅外譜圖呈現出明顯的醛類化合物特征，1 726 cm-1（s）處為R—CHO的特征峰，2 918 cm-1（m）和2 858 cm-1（m）處為甜瓜醛上—CH3的不對稱與對稱伸縮振動峰，2 928 cm-1（m）處為C—CH2—C不對稱伸縮振動峰。2 812 cm-1（w）和2 705 cm-1（w）處譜帶是—CHO的Fermi共振帶，這是由于醛基中C—H伸縮振動和C—H彎曲振動（1 377 cm-1）的倍頻之間Fermi共振的貢獻。

圖2 傅里葉變換紅外色譜分析和反應示意圖Fig.2 FTIR spectra and reaction routes

對比TCS、MTCS兩條譜帶，TCS譜帶3 450 cm-1（s）處為伯胺的N—H伸縮振動峰[20]，而MTCS譜帶上此峰已經不明顯或不存在，這是由于甜瓜醛的醛基與殼聚糖上的胺基發生了席夫堿反應，生成了新的化學鍵。同時醛基還與殼聚糖上的羥基發生縮醛反應，減少了3 350 cm-1附近O—H縮振動的干擾，因此MTCS譜帶在3 275（s）、3 191 cm-1（s）處出現了雙峰，判斷為伯酰胺吸收峰。

對比MTCS和OMTCS兩條譜帶，MTCS譜帶在1 654 cm-1（s）處為C＝C鍵的伸縮振動峰，而OMTCS譜帶在此范圍處的1 669 cm-1（w）峰為酰胺I帶C＝O鍵的吸收峰[21]。在殼聚糖活潑胺基的存在下，可以說明硫醇的巰基與MTCS上的碳碳和碳氮雙鍵發生了Micheal加成反應[22-23]，生成了新的化學鍵。并且OMTCS譜帶上2 920 cm-1（m）處的C—CH2—C不對稱伸縮振動峰也可證明甜瓜醛或硫醇成功接枝到殼聚糖上。

2.3 X射線光電子能譜分析

如圖3所示，在OMTCS全譜中看到，峰位284.4 eV處是C 1s軌道的電子束縛能[24]，碳元素占比為70.86%，相較于TCS全譜圖中的碳元素占比60.18%，增加了10.7%，表明有甜瓜醛或正十八硫醇接枝到了OMTCS上。而峰位162.79 eV處是S 2p軌道的電子束縛能，硫元素占比為1.17%，證明了OMTCS上硫元素的存在。通過進一步分析OMTCS的精細S譜圖發現了劈裂峰的存在，2 個峰位分別為163.18、164.28 eV，分別是2p3/2和2p1/2軌道的電子束縛能，164.28 eV為R—SH鍵的結合能，163.18 eV為R—S—R鍵的結合能。而同一類型的硫也會以劈裂峰的形式存在[25]，因此判斷此劈裂峰為硫醚鍵的結合能，證明了正十八硫醇在殼聚糖氣凝膠上成功接枝。

圖3 TCS和OMTCS X射線光電子能譜分析Fig.3 XPS analysis of TCS and OMTCS

比較OMTCS和TCS的精細C譜圖，峰位284.8 eV同為C—C鍵的結合能，OMTCS譜圖中峰位286.36 eV與TCS譜圖中峰位286.46 eV同為殼聚糖C—O—C鍵的結合能[26]。而OMTCS譜圖中的峰位288.07 eV為C＝N鍵的結合能，這是由于甜瓜醛的—CHO與殼聚糖的—NH2發生席夫堿反應生成了C＝N鍵，進一步說明甜瓜醛接枝到了殼聚糖氣凝膠上。

比較OMTCS和TCS的精細N譜圖，OMTCS譜圖中的峰位是399.25 eV，查閱相關資料發現峰位400 eV是C—NH2鍵的結合能，由此可以判斷是—NH2得質子后，H＋引起了峰位偏離[27]。而TCS譜圖中的峰位397.77 eV為鈉磷氧氮化物[(NaPO3)n—xN]的結合能[28]，這是TPP的P3與殼聚糖的—N發生離子交聯的結果。

2.4 X射線衍射儀分析

如圖4所示，對比OMTCS和TCS兩個譜圖，雙峰處在同一位置，但是OMTCS譜圖的雙峰明顯更窄。使用軟件MDI Jade 6計算其結晶度，除去半峰寬5°以上的峰。OMTCS的結晶度為12.45%，TCS的結晶度僅為0.05%。因為殼聚糖氣凝膠從TCS轉變為OMTCS后，部分離子鍵破裂，新的共價鍵生成，甜瓜醛直鏈分子與殼聚糖分子交錯，導致殼聚糖氣凝膠分子排列更為緊密，提高了殼聚糖氣凝膠的結晶度[29]。

圖4 TCS和OMTCS X射線衍射譜分析Fig.4 XRD analysis of TCS and OMTCS

2.5 熱重分析

如圖5所示，對比OMTCS和TCS兩條圖譜可以看到，前者在81.9 ℃時質量損失速率達到第1個峰值-2.15%/min，后者在85.5 ℃時質量損失速率達到第1個峰值-2.72%/min，可以推斷在此范圍是結合水質量的損失[30]。OMTCS在284.7 ℃時質量損失速率達到第2個峰值-8.97%/min，而TCS質量損失速率的第2個峰值在305.6 ℃時，最大質量損失速率為-9.04%/min。兩者都在206～330 ℃范圍內質量損失速率進一步增加，這是由于升溫引起殼聚糖C—O—C等化學鍵的斷裂。熱穩定性與化學鍵的能量有關，而OMTCS質量更容易損失是因為交聯后生成的共價鍵較TCS的離子鍵結合能低，加熱使分子結構更容易被破壞，導致質量損失速率更高。加熱到798.8 ℃時，OMTCS共損失94.07%的質量，TCS損失了71.82%的質量。結果表明，OMTCS熱穩定性較TCS有所下降。

圖5 TCS和OMTCS熱重分析Fig.5 TGA of TCS and OMTCS

2.6 接觸角測量儀測試

圖6A1為油滴下落后100 ms時的變化，此時油滴幾乎已經滲進其表面，接觸角為29.7°，在190 ms時（圖6A2）油滴已經完全滲進OMTCS的表面，油滴接觸角為0°。表明OMTCS表面對油滴具有超強的親和力。殼聚糖原本為親水物質，但是經改性制備得到的OMTCS在水滴測試下，水滴幾乎以完整的球狀附著在OMTCS表面，其接觸角為126°（圖6B），呈現出良好的疏水性[30]。結果證明了改性后的殼聚糖氣凝膠具備親脂的特性。

圖6 油滴和水滴在OMTCS表面的接觸角測試圖Fig.6 Contact angle test of oil and water droplets on OMTCS surface

2.7 OMTCS負載姜黃素

姜黃素作為一種脂溶性藥物，對于OMTCS有著良好的親和力。如圖7所示，溫度在17 ℃時，在60 min達到最大負載量66.2 mg/g。溫度27 ℃時，在40 min達到最大負載量70.5 mg/g。而溫度37 ℃時的最大負載量為62.9 mg/g，時間為40 min。由于溫度較低時分子熱運動慢，限制了姜黃素-乙醇溶液在OMTCS結構內部擴散，因此相較于27 ℃，溫度在17 ℃時的吸附平衡時間后移，最大負載量減少。當吸附溫度為37 ℃時，分子熱運動雖然加快，但是由于吸附時放熱，溫度升高反而導致吸附平衡左移，造成最大負載量下降。3 組溫度的負載測試幾乎都在100 min時到最終平衡。結果表明，OMTCS負載姜黃素的最佳溫度為27 ℃，最佳負載時間為40 min。

圖7 OMTCS在不同溫度下對姜黃素的吸附Fig.7 OMTCS loading of curcumin at different temperatures

2.8 姜黃素緩釋及抗氧化性能

如圖8A所示，姜黃素在腸液中7 h內持續緩慢釋放，恰好是大多數食物在人體小腸內的停留時間[31]。緩釋率在7 h達到最大值，直至24 h都趨于平緩，最大緩釋率達到89.6%。姜黃素在胃液中緩釋2.5 h達到平衡，最大緩釋率為19.3%，較腸液中的緩釋效率低。判斷是由于胃液極酸的環境下加速了姜黃素的分解。圖8B表明，OMTCS-姜黃素在24 h內持續具有自由基清除能力，自由基最大清除率為51.5%，而對照組中的姜黃素僅在40 min就基本反應完畢，達到自由基最大清除率87.54%。證明OMTCS-姜黃素具備良好的緩釋性能。

圖8 姜黃素體外模擬緩釋（A）和OMTCS-姜黃素抗氧化性測試（B）Fig.8 In vitro sustained release of curcumin (A) and antioxidant activity of OMTCS-curcumin (B)

3 結 論

利用離子交聯法制備得到殼聚糖氣凝膠的基礎上，以甜瓜醛和正十八硫醇作為交聯改性劑，最終制備得到OMTCS。通過傅里葉變換紅外光譜和X射線光電子能譜分析，證明了甜瓜醛與殼聚糖發生了席夫堿反應而成功接枝得到MTCS。在后續實驗中，發現了直鏈醛對于殼聚糖氣凝膠的交聯效果優于其他醛類。并且醛本身的熱穩定性對于交聯反應的結果也十分重要。之后利用正十八硫醇在MTCS上進一步加成，在X射線光電子能譜分析下測得OMTCS表面硫元素含量為1.17%。通過交聯改性殼聚糖氣凝膠的疏水性能得到極大改善，從接觸角測試可以看到，OMTCS與水滴的接觸角達到126°，體現了OMTCS良好的疏水特性。對姜黃素的負載研究結果表明，OMTCS對于脂溶性藥物姜黃素有著良好的吸附效果。在室溫27 ℃達到最大負載量70.5 mg/g。體外模擬緩釋研究結果表明，OMTCS-姜黃素在腸液中有著良好的緩釋效果，能夠在7 h內持續緩釋，最大緩釋率達到89.6%，緩釋率優于復合納米顆粒-姜黃素的83.8%[32]。本研究為殼聚糖基載藥材料對于親脂性藥物的負載和緩釋提供了參考。