基于微生物菌群調控的枯草芽孢桿菌改善低鹽發酵魚露品質作用機制

李 琰，李文靜，李春生*，楊大俏，王悅齊，王 迪，陳勝軍，吳燕燕，李來好*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東 廣州 510300；3.三亞熱帶水產研究院，海南省深遠海漁業資源高效利用與加工重點實驗室，海南 三亞 572018）

魚露是一種以低值海捕魚類為主要原料，經長時間自然發酵制得的水產調味品[1]。魚露風味獨特，營養豐富，是東南亞地區和我國南方沿海一帶最受歡迎的調味品之一。為抑制腐敗微生物的生長和代謝，傳統的魚露發酵工藝通常采用高鹽鹽漬（加鹽量為25%～30%）的發酵方式[2]。在傳統發酵魚露發酵過程中，耐鹽微生物（主要是耐鹽細菌）通過其復雜的生化代謝途徑產生各種代謝產物，進而產生魚露獨特的風味。然而，由于高鹽對微生物代謝的抑制作用，依靠自然發酵過程促使魚露形成獨特風味所需要的時間過長，通常需要1～3 a，而且品質易受發酵環境影響而不穩定，極大地限制了魚露產業的發展[3]。因此，如何縮短魚露發酵周期是目前我國魚露產業亟待解決的難題。

低鹽發酵是目前快速發酵魚露常用的方式，而且低鹽魚露產品符合現代低鹽健康飲食的理念。然而，由于加鹽量較低，無法有效抑制腐敗微生物的生長，魚露容易腐敗變質，因此需要添加合適的微生物發酵劑。目前魚露微生物發酵劑多選用高產蛋白酶的菌株，主要包括枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）[4-5]、動性球菌屬（Planococcus）[6]、青霉菌屬（Penicillium）[7]、嗜鹽桿菌屬（Halobacterium）[8]等。但是多數菌株產蛋白酶能力低，特別是在高鹽環境下存在蛋白酶易失活等問題，限制了其在魚露產業中的應用。此外，發酵菌株的添加能夠改變發酵微環境，影響微生物菌群結構，但是目前大多研究集中在加菌發酵對魚露品質的影響，而忽略了對發酵過程發酵菌株的監測以及加菌后對微生物菌群結構的影響[9-10]，難以確定魚露品質的改善機制。

課題組前期從傳統發酵魚露中篩選得到1 株高產蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B-2，該菌具有很強的耐鹽性并在高鹽條件下具有較穩定的產蛋白酶能力[11]，具有改善低鹽魚露品質的應用潛力。因此，本研究以B.subtilisB-2為魚露發酵劑，研究加菌發酵對低鹽魚露發酵過程中微生物菌群、生物胺和氨基酸態氮（amino acid nitrogen，AAN）的影響，通過構建相關性網絡圖，進一步闡述B.subtilisB-2加菌發酵對低鹽發酵魚露品質的影響機制，以期為我國傳統發酵魚露的提質增效提供重要理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B.subtilisB-2為實驗室保存菌株，分離自汕頭魚露廠有限公司的傳統魚露發酵液[11]；冰鮮藍圓鲹 廣州市華潤萬家（客村店）；FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設備

809 Titrando型自動點位滴定儀 瑞士萬通公司；L C-2 0 A D 高效液相色譜儀 日本島津公司；NanoDrop2000超微量分光光度計 美國NanoDrop公司；3 K 3 0 臺式高速冷凍離心機 德國S i g m a 公司；Mastercycler nexus型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 藍圓鲹魚露的制備

將冰鮮藍圓鲹用絞肉機絞碎，按照18%（m/m）的比例加入食用鹽，混勻后均分成兩組備用。將菌株B.subtilisB-2培養3 d，于4 ℃、12 000×g離心10 min，用0.85%無菌生理鹽水重懸，將菌體按106CFU/g的終濃度加入到其中一組原料中，攪拌均勻，作為低鹽加菌發酵組（B）。向另一組原料中加入相同體積的無菌生理鹽水用于魚露的自然發酵，作為低鹽自然發酵組（C）。將混勻的兩組原料放入玻璃發酵罐中，用8 層紗布覆蓋，每5 d攪拌一次，在35 ℃自然發酵45 d。發酵前取魚糜（B0和C0）用于微生物菌群分析。在發酵5（B5和C5）、10（B10和C10）、15（B15和C15）、30（B30和C30）、45 d（B45和C45）后分別取魚露發酵液，于4 ℃、12 000×g離心15 min，上清液用于AAN和生物胺的測定，下層菌體沉淀用于微生物菌群分析。

1.3.2 生物胺含量的測定

取1.0 g魚露發酵上清液，加入3.0 mL的HCl溶液（0.1 mol/L）混勻，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液定容到5.0 mL，制成生物胺提取液。取1.0 mL生物胺提取液，加入1.5 mL碳酸鹽緩沖液（pH 11.0），加入1.0 mL DNS-Cl的丙酮溶液（10 g/L），在40 ℃水浴鍋中避光反應1 h。加入0.20 mL脯氨酸溶液（100 g/L）混勻，室溫反應1 h后，加入3.0 mL正庚烷混勻。待液體分層后取1.0 mL上層液，氮氣吹干，用1.0 mL色譜級甲醇溶解，微濾（0.22 μm）后備用。利用LC-20AD高效液相色譜儀檢測樣品中生物胺含量，色譜柱為反相色譜柱ChromCoreTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，將55%甲醇溶液作為流動相平衡色譜柱，設置進樣體積為20.0 μL。紫外檢測波長254 nm，隨后以0.8 mL/min的流速進行梯度洗脫，洗脫程序參考Zhao Yue等[12]的方法。根據8 種生物胺的保留時間和峰面積，對魚露中的生物胺進行定量分析。

1.3.3 AAN的測定

參照文獻[13]的電位滴定法并稍作修改。取1.0 mL魚露發酵上清液，用超純水定容至100 mL，混勻備用。使用809 Titrando型自動點位滴定儀測定AAN含量。設置電位滴定儀自動加甲醛5 mL，固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性后，用NaOH滴定，根據堿液消耗量計算樣品中AAN含量。

1.3.4 微生物群落分析

采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒，提取樣品中微生物群落的DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測D N A 的純度。使用引物3 3 8 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），通過PCR擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區域。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，27 個循環；72 ℃穩定延伸10 min；最后在4 ℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進行純化，純化的PCR擴增子在Illumina MiSeq PE300平臺（Illumina，USA）上進行成對末端測序[14]。數據在Majorbio Cloud（Majorbio，China）在線平臺上進行分析。通過Fastp v0.19.6對原始測序讀數進行分解復用和質量過濾，然后用Flash v1.2.11進行合并。采用Mothur v1.30.2對微生物菌群的α多樣性指數進行分析，基于主成分分析（principal component analysis，PCA）對微生物菌群的β多樣性進行分析。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 加菌發酵對低鹽魚露發酵過程微生物菌群α多樣性的影響

α多樣性指數是分析微生物菌群豐富度和均勻度的重要指標，主要包括覆蓋率、Sobs指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數。覆蓋率代表高通量測序結果的覆蓋程度，該值越接近1，說明測得的微生物菌群結果越真實[16]。由圖1可知，每個魚露樣品的覆蓋率均在0.99以上，說明樣品中絕大多數微生物都被檢測到，測序準確性較好。Sobs指數表示觀察到的OTU數[16]，該指數可以直觀表現樣品中微生物菌群的豐富度。隨著發酵的進行，低鹽自然發酵組的Sobs指數均呈逐漸降低的趨勢，表明微生物菌群的豐富度逐漸降低。加菌發酵后，微生物菌群在每個發酵時間的Sobs指數均顯著降低。ACE指數和Chao指數同樣用于評價魚露樣品中物種的豐富度[17]。與Sobs指數的變化趨勢相似，隨著發酵時間的延長，Chao指數和ACE指數在低鹽自然發酵組中逐漸降低，且加菌發酵后顯著降低，結果表明B.subtilisB-2加菌發酵可以顯著降低微生物菌群的豐富度。Shannon指數和Simpson指數可以反映微生物群落的均勻度[18]。結果顯示，低鹽自然發酵組微生物菌群的Shannon指數明顯高于低鹽加菌發酵組，而Simpson指數則明顯高于低鹽加菌發酵組，表明B.subtilisB-2加菌發酵可以顯著降低魚露中微生物菌群的均勻度。綜合上述α多樣性指數，加菌發酵后魚露中微生物群落的豐富度和均勻度都呈降低趨勢，表明B.subtilisB-2加菌發酵后能夠顯著抑制魚露發酵過程中大多數微生物菌群的生長。

圖1 不同發酵時間下低鹽自然發酵魚露和低鹽加菌發酵魚露中微生物菌群的α多樣性指數變化Fig.1 Changes in α diversity indexes of microbial community in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times

2.2 加菌發酵對低鹽魚露發酵過程微生物菌群β多樣性的影響

微生物菌群β多樣性分析可以用于評價不同樣品中微生物菌群結構的相似性[18]。基于PCA解析加菌發酵對低鹽魚露發酵過程微生物菌群β多樣性的影響，結果如圖2所示。可以看出，低鹽加菌發酵組與低鹽自然發酵組微生物菌群差異明顯；低鹽自然發酵組的微生物菌群在發酵前期（C0、C5、C10、C15）與后期（C30、C45）也顯示出較明顯的差異，而加菌發酵組的微生物菌群在整個發酵期間差異不明顯。結果表明，低鹽自然發酵魚露樣品中微生物群落組成不穩定，在發酵前期的優勢微生物，在發酵后期逐漸被其他微生物菌屬替代，導致微生物群落組成結構發生改變；而對于加菌發酵組，添加B.subtilisB-2后魚露微生物群落組成更加穩定，在整個發酵過程中變化較小。

圖2 不同發酵時間下低鹽自然發酵魚露和低鹽加菌發酵魚露中微生物菌群的β多樣性分析Fig.2 β-Diversity analysis of microbial community in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times

2.3 加菌發酵對低鹽魚露發酵過程微生物群落組成的影響

微生物種類和比例對魚露的品質和風味均有較大影響[19]。因此，本研究對魚露發酵過程中的微生物種類進行監控，對魚露品質的改善有重要作用。

由圖3 A 可知，在低鹽自然發酵組的魚露樣品中Proteobacteria和Cyanobacteria是主要的門類，且Proteobacteria的豐度隨著發酵時間延長逐漸增加，在發酵后期相對豐度達到64.89%。由圖3B可知，在屬水平上，共監測到31 個主要的微生物屬（相對豐度＞0.1%），其中原料魚中（C 0）豐度最高的為C y a n o b i u m、Pseudomonas、Synechococcus、Delftia。Cyanobium的豐度隨發酵時間延長先上升后下降，發酵5 d相對豐度為44.90%，在發酵45 d下降至12.46%。Pseudomonas在發酵前期占比很小，在發酵至45 d代替Cyanobium，成為最主要的菌屬，說明Pseudomonas可能更適合在低鹽發酵魚露環境中生長。在以鳀魚為原料的韓國傳統魚露（Myeolchi-Aekjeot）中占絕對優勢的是Halanaerobium和Lactobacillus[20]，在以鳀魚為原料的我國傳統發酵魚露中占絕對優勢的是Halococcus、Halanaerobium、Halomonas和Tetragenococcus[21]，而本研究以藍圓鲹為原料的低鹽發酵魚露中上述菌屬均不是核心菌屬，這說明原料魚體攜帶的和發酵環境中的微生物以及鹽度對后續發酵過程中微生物種類的影響較大。

圖3 不同發酵時間下低鹽自然發酵魚露和低鹽加菌發酵魚露中微生物菌群在門（A）和屬（B）上相對豐度變化Fig.3 Change in relative abundance of microbial community in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times at the phylum (A) and genus (B) levels

由圖3A可知，Firmicutes在加菌發酵魚露整個發酵過程的相對豐度均超過75%，是發酵過程中的主要微生物門類。由圖3B可知，在屬水平上，僅檢測到12 個主要的微生物屬（相對豐度＞0.1%），其中Bacillus始終占主導地位，發酵起始（B0）的相對豐度達到96.16%，隨著發酵時間的延長先下降后上升，在發酵末期達到93.69%；其次是Pseudomonas和Stenotrophomonas。與低鹽自然發酵組相比，加菌發酵后微生物多樣性顯著降低，表明B.subtilisB-2具有很強的生存能力，可以抑制低鹽發酵環境中Cyanobium、Synechococcus、Achromobacter等腐敗微生物的生長。

2.4 加菌發酵對低鹽魚露發酵過程生物胺含量的影響

生物胺廣泛存在于發酵食品中，主要是由游離氨基酸在微生物產生的氨基酸脫羧酶催化下脫羧基形成的[22]。生物胺也是我國魚露中重要的質量安全評價指標，控制生物胺對于提升魚露的品質具有重要意義[23]。有研究發現，傳統自然發酵魚露中含有較高的組胺、酪胺、腐胺和尸胺[24]。在本研究發現相似的研究結果，組胺、腐胺、尸胺和酪胺是低鹽自然發酵魚露中的關鍵生物胺（圖4）。在發酵5 d，魚露樣品中各生物胺含量都很低，隨著發酵的進行，8 種生物胺含量均有所增加。在低鹽自然發酵魚露中，組胺、酪胺、苯乙胺、色胺、亞精胺和精胺的含量呈先增長后下降的趨勢，而腐胺和尸胺的含量均在發酵末期達到最大。組胺和酪胺作為毒性最強的生物胺，過量攝入會導致血壓異常、消化系統紊亂、頭痛和神經中毒[25]。食品法典委員會規定，魚露中的組胺不得超過400 mg/kg[22]。本研究中，低鹽自然發酵魚露中組胺和酪胺的含量均在發酵30 d達到最大，分別為289.2 mg/kg和271.56 mg/kg，在發酵末期組胺下降至275.16 mg/kg，酪胺下降至260.05 mg/kg，表明低鹽自然發酵魚露的安全性符合食品法典委員會的規定。雖然尸胺和腐胺本身沒有毒性，但它們可以增加組胺的毒性[26]。高濃度的尸胺和腐胺可能會增加生物胺中毒的風險。研究發現，高鹽發酵魚露在發酵結束時（發酵12 個月）組胺、酪胺、腐胺、苯乙胺、色胺、亞精胺和尸胺含量分別為121.97、93.49、81.22、2.90、10.52、13.29 mg/kg和133.75 mg/kg[24]。結果表明，除了尸胺，發酵末期（45 d）低鹽魚露中其他生物胺的濃度明顯高于高鹽魚露，特別是組胺、酪胺和腐胺。因此，未來對低鹽魚露的研究應著重于控制這些生物胺，以減少其潛在的毒性。在低鹽加菌發酵魚露中，多數生物胺含量的變化趨勢與低鹽自然發酵魚露相似，但是大多數生物胺的含量顯著下降，特別是組胺、腐胺、尸胺和酪胺等關鍵生物胺，其含量在發酵末期分別下降了25.9%、35.6%、23.6%和9.3%。結果表明，B.subtilisB-2加菌發酵的低鹽魚露具有更高的安全性。

圖4 不同發酵時間下低鹽自然發酵魚露和低鹽加菌發酵魚露中生物胺和AAN含量變化Fig.4 Changes in concentrations of biogenic amines and amino acid nitrogen in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times

2.5 加菌發酵對低鹽魚露發酵過程AAN含量的影響

AAN含量是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是魚露最主要的品質指標之一，氨基酸含量越高，表明魚露的品質越高、鮮味越好[27]。加菌對低鹽魚露發酵過程AAN含量的影響如圖4所示。結果發現，隨著發酵時間的延長，低鹽自然發酵魚露和低鹽加菌發酵魚露的AAN含量均呈顯著增加的趨勢。當發酵10 d，低鹽自然發酵魚露的AAN質量濃度達到0.73 g/100 mL，根據SB/T 10324—1999《魚露》[13]，達到二級魚露的標準（＞0.65 g/100 mL）；發酵30 d，AAN質量濃度達到0.92 g/100 mL，達到國家一級魚露標準（＞0.9 g/100 mL）。袁樹昆[28]對低鹽魚露（鹽度為18%）發酵過程中的AAN進行了測定，結果顯示，在發酵30 d，AAN超過1.2 g/100 mL，達到一級魚露標準，與本研究結果相似。與傳統發酵魚露相比，降低鹽濃度可以提高發酵速度，這可能是因為傳統發酵魚露的高鹽環境抑制了微生物的生長和代謝[29]，而在低鹽環境下微生物生長和代謝較快，且微生物菌群更為豐富，魚肉蛋白質的分解速度加快。因此，對于AAN指標來說，低鹽發酵具有明顯優勢。與低鹽自然發酵魚露相比，加菌發酵魚露的AAN含量明顯增加，其中發酵15 d的AAN質量濃度可達到1.23 g/100 mL，超過一級魚露的AAN含量標準，而此時自然發酵魚露的AAN質量濃度僅為0.79 g/100 mL，為二級魚露。在泰國傳統發酵食品thua-nao[30]中也有相似的結果，添加B.subtilis可以提高AAN含量，發酵速率更高。這可能是因為B.subtilisB-2具有很高的耐鹽性并且所產的蛋白酶在高鹽條件下仍具有較強的活力[11]，因此可以加速原料魚蛋白分解為氨基酸，從而促進AAN的形成。結果表明，B.subtilisB-2加菌發酵可以有效縮短低鹽魚露發酵時間并且提升其品質。

2.6 低鹽魚露品質指標與微生物菌屬間的相關性分析

微生物代謝在傳統發酵食品品質形成上發揮著核心作用。為研究低鹽自然發酵魚露和加菌發酵魚露品質形成機制，本研究首先利用P e a r s o n相關性檢驗研究主要微生物菌屬、8 種生物胺、AAN、α多樣性指數間的相關性。如圖5A所示，在低鹽自然發酵組中，3 1 個微生物菌屬分成2 個明顯的聚類，包括聚類1（Bacillus、Staphylococcus、Vagococcus、Rhizobium、Ralstonia、Paraburkholderia、Actinomarina、Peptoniphilus、Ornithinimicrobium、Pontibaca、Paracoccus、Aequorivita、Psychrobacter、Roseovarius、Clostridiisalibacter、Delftia、Gallicola、Peptostreptococcus、Dietzia、Brevibacterium、Brachybacterium、Cyanobium、Synechococcus、c h l o r o p l a s t）和聚類2（S t e n o t r o p h o m o n a s、Rhodococcus、Achromobacter、Brucella、Pseudomonas、Tetragenococcus、Erysipelothrix）。聚類1中的大部分微生物菌屬與Sobs指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數、苯乙胺和色胺呈正相關，與Simpson指數、AAN、組胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺和精胺呈負相關，聚類2中的大部分微生物菌屬則反之。結果表明，低鹽自然魚露發酵過程中微生物豐富度和均勻度的下降可能是由聚類1中微生物菌屬豐度的下降引起，而發酵過程AAN和關鍵生物胺（組胺、腐胺、尸胺、酪胺）的增加主要可能是由聚類2中微生物菌屬的代謝引起。如圖5B所示，在加菌發酵組中，12 個微生物菌屬分成3 個明顯的聚類，包括聚類1（Bacillus、Synechococcus）、聚類2（Pseudomonas、chloroplast、Stenotrophomonas）和聚類3（Cyanobium、Achromobacter、Rhodococcus、Brucella、Tetragenococcus、Staphylococcus、Delftia）。聚類1中的微生物菌屬與Sobs指數、Chao指數、ACE指數、Simpson指數的正相關性較高，聚類2中的微生物菌屬與Shannon指數、苯乙胺、亞精胺、腐胺產生明顯的正相關性，聚類3中的微生物菌屬與AAN、組胺、尸胺、酪胺、色胺和精胺正相關性較高。

圖5 微生物菌屬與低鹽魚露品質指標間的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between microbial genera and quality indexes in low-salt fish sauce

進一步根據Pearson相關系數構建了微生物菌屬與生物胺、AAN、α多樣性指數間的相關性網絡圖（|r|＞0.6且P＜0.05）。如圖5C所示，在低鹽自然發酵組中，與Sobs指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數顯著正相關的菌屬主要集中在Brevibacterium、Dietzia、Paracoccus、Aequorivita、Brachybacterium，表明這些微生物菌屬豐度的下降是低鹽自然發酵魚露發酵末期微生物多樣性下降的主要原因。Stenotrophomonas與大多數生物胺（4 種）呈顯著正相關，其次是Pseudomonas、Ralstonia、Erysipelothrix（2 種）。Stenotrophomonas是與尸胺（r=0.8 1 9）、組胺（r=0.7 3 6）、腐胺（r=0.699）和酪胺（r=0.699）高度相關的主要菌屬，有助于它們在發酵后期濃度增加。與色胺產生有關的菌屬最多，包括Staphylococcus（r=0.622）、Delftia（r=0.882）、Ralstonia（r=0.679）、Paraburkholderia（r=0.695）、Ornithinimicrobium（r=0.784）、Paracoccus（r=0.769）、Aequorivita（r=0.781）、Brachybacterium（r=0.624）、Rhizobium（r=0.664）、Gallicola（r=0.749）、Roseovarius（r=0.752）、Pontibaca（r=0.670）。其次是與尸胺產生有關的菌屬，包括Pseudomonas（r=0.735）、Stenotrophomonas（r=0.819）、Achromobacter（r=0.632）、Rhodococcus（r=0.642）和Brucella（r=0.636）。Pseudomonas和Stenotrophomonas是造成食品儲存期間腐敗的主要微生物菌屬[31]，且Pseudomonas被確定為水產品中產生生物胺的核心腐敗菌[32-34]。在本研究中，應進一步控制低鹽魚露中的腐敗微生物，特別是Pseudomonas和Stenotrophomonas，以抑制生物胺的產生。AAN與多個微生物菌屬呈顯著正相關，包括Tetragenococcus（r=0.707）、Stenotrophomonas（r=0.825）、Achromobacter（r=0.744）、Rhodococcus（r=0.752）、Brucella（r=0.748）、Erysipelothrix（r=0.654），說明這些菌屬有可能產生蛋白酶，有利于魚肉蛋白質的分解，從而導致AAN增加。

如圖5D所示，在加菌發酵組中，與α多樣性指數顯著相關的菌屬明顯減少，其中與Shannon指數顯著正相關的菌屬主要包括Pseudomonas（r=0.951）、Stenotrophomonas（r=0.797）、chloroplast（r=0.756），說明這些菌屬在維持加菌發酵魚露微生物菌群均勻度方面發揮重要作用。Tetragenococcus（r=0.611）、Stenotrophomonas（r=0.707）、Delftia（r=0.667）與AAN呈顯著正相關，表明這些菌屬在魚露發酵過程AAN變化中發揮著重要作用。微生物菌屬與多種生物胺之間呈顯著正相關，其中與組胺生成顯著正相關的有Stenotrophomonas（r=0.769）、Delftia（r=0.699）；與酪胺顯著正相關的有Tetragenococcus（r=0.611）、Stenotrophomonas（r=0.649）、Delftia（r=0.638）；與腐胺顯著正相關的有Stenotrophomonas（r=0.724）；與尸胺顯著正相關的有Stenotrophomonas（r=0.612）、Delftia（r=0.628）。結果表明，Stenotrophomonas在加菌發酵魚露中生物胺形成方面發揮著重要作用，這與自然發酵魚露的結果一致。

2.7 加菌發酵改善低鹽發酵魚露品質的作用機制

為進一步揭示B.subtilisB-2加菌發酵改善低鹽發酵魚露品質的作用機制，將發酵末期低鹽自然發酵魚露和加菌發酵魚露間的微生物菌屬、生物胺、AAN、α多樣性指數進行Pearson相關性分析，并進一步構建相關性網絡圖（|r|＞0.6且P＜0.05）。

如圖6所示，僅有Bacillus和Staphylococcus與Sobs指數、Chao指數、ACE指數和Shannon指數呈顯著正相關，而與Simpson指數呈顯著負相關，而其他微生物菌屬則正好相反。同時，只有Bacillus和Staphylococcus與AAN呈顯著正相關，與組胺、腐胺、尸胺、酪胺等關鍵生物胺呈顯著負相關。發酵食品中的核心菌群是指微生物菌屬豐度占絕對豐度并能在其風味或品質起核心作用的菌群[3,12]。如圖7所示，B.subtilisB-2加菌發酵后，Staphylococcus的相對豐度僅從0.05%增加到0.12%。因此雖然Staphylococcus與品質指標的改善起顯著相關，但是在其中占比很小，并不是發酵食品品質改善的核心菌群。相反，B.subtilisB-2加菌發酵后，Bacillus在發酵末期的相對豐度從0.04%顯著增加到93.63%，其在低鹽魚露品質改善上發揮著核心作用，是加菌發酵魚露中的核心微生物菌群。結果表明，B.subtilisB-2加菌發酵后，腐敗微生物種類和豐度的下降，AAN含量的提高，以及組胺、腐胺、尸胺、酪胺等關鍵生物胺含量的下降主要由Bacillus即所添加的發酵劑代謝引起的。本研究表明B.subtilisB-2作為發酵劑具有很好的改善低鹽發酵魚露品質的作用，具有在低鹽發酵魚露中應用的潛力。

圖6 基于發酵末期低鹽自然發酵魚露和加菌發酵魚露間的微生物菌屬與品質指標的相關性網絡圖Fig.6 Correlation network map between microbial genera and quality indexes in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at the end of fermentation

圖7 B. subtilis B-2加菌發酵改善魚露品質的作用機制圖Fig.7 Mechanism for quality improvement of low-salt fish sauce by fermentation with B. subtilis B-2

3 結 論

B.subtilisB-2加菌發酵能夠顯著降低低鹽魚露發酵過程中微生物群落的豐富度和均勻度。在低鹽自然發酵魚露中共檢測到31 種主要的微生物菌屬（相對豐度＞0.1%），其優勢菌屬從發酵初期的Cyanobium變為發酵末期的Pseudomonas；而加菌發酵后，微生物菌屬減少至12 種，其中Bacillus始終占主導地位，在發酵末期的相對豐度達到93.69%，腐敗微生物豐度顯著降低。B.subtilisB-2加菌發酵能夠顯著抑制低鹽魚露中組胺、腐胺、尸胺和酪胺的生成，其含量在發酵末期較自然發酵魚露分別下降了25.9%、35.6%、23.6%和9.3%。B.subtilisB-2加菌發酵可顯著增加低鹽魚露的AAN含量，其中發酵15 d的AAN可達到1.23 g/100 mL，超過一級魚露的AAN含量標準，而此時自然發酵魚露的AAN僅為0.79 g/100 mL（僅達到二級魚露）。相關性網絡圖分析結果顯示，在低鹽自然發酵組中，與Sobs指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數顯著正相關的菌屬主要集中在Brevibacterium、Dietzia、Paracoccus、Aequorivita、Brachybacterium，表明這些微生物菌屬豐度的下降是低鹽自然發酵魚露發酵末期微生物多樣性下降的主要原因；在低鹽自然發酵魚露和低鹽加菌發酵魚露中，Stenotrophomonas均與多種生物胺呈顯著正相關，表明其在低鹽魚露生物胺產生中發揮核心作用；B.subtilisB-2加菌發酵后，腐敗微生物種類和豐度的下降、AAN含量的提高以及關鍵生物胺含量的下降主要由Bacillus即所添加的發酵劑代謝引起。B.subtilisB-2作為發酵劑具有在改善低鹽發酵魚露品質中的應用潛力。