嬰兒配方乳粉中食源性致病菌雙重ERA快速檢測(cè)方法的建立

林志偉，王 帥，王迎春，吳占文，李 濤，李紅娜，楊艷歌,*，袁 飛,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全），北京 100176；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000）

嬰兒食品安全關(guān)乎下一代健康成長(zhǎng)，千萬(wàn)家庭的幸福和國(guó)家民族的未來(lái)。研究顯示，0～6 個(gè)月嬰幼兒的腸道菌群尚處于發(fā)育階段，腸道中雙歧桿菌等有益菌尚未占據(jù)優(yōu)勢(shì)[1]。一旦誤食了含有食源性致病菌的嬰兒配方乳粉，極易導(dǎo)致結(jié)腸炎、菌血癥等疾病的發(fā)生，危害嬰兒的生命安全。乳粉中常見(jiàn)的食源性致病菌主要有克羅諾桿菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌等。克羅諾桿菌舊稱阪崎腸桿菌，對(duì)各年齡段人群均具有感染性，尤其是免疫功能低下或不健全的老年人和嬰兒[2]。嬰兒感染后常出現(xiàn)腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等癥狀[3]，且致死率高達(dá)40%～80%[4-5]。沙門(mén)氏菌是一類在環(huán)境中廣泛存在且能夠引發(fā)食物中毒的革蘭氏陰性桿菌[6]，據(jù)報(bào)道，全球每年大約有9 000多萬(wàn) 例的沙門(mén)氏菌感染事件發(fā)生[7]。單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌是兩類會(huì)導(dǎo)致食物中毒的革蘭氏陽(yáng)性菌[8]，誤食污染這2 類細(xì)菌的乳粉會(huì)導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)單核細(xì)胞增多、腦膜炎、敗血癥等癥狀[9]，嚴(yán)重威脅嬰兒的生命安全。

目前微生物檢測(cè)采用的標(biāo)準(zhǔn)方法是微生物培養(yǎng)法[10]，該方法雖然易于推廣、結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長(zhǎng)，結(jié)果易受操作人員的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)影響[11]。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足，研究者們開(kāi)發(fā)了多種新型檢測(cè)手段。如王仲敏等[12]根據(jù)產(chǎn)酸克雷伯氏菌半乳糖醛酸酶基因建立了實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法，檢測(cè)時(shí)間相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法縮短了一半。Asgari等[13]將表面增強(qiáng)拉曼光譜與免疫探針技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種能夠同時(shí)分離檢測(cè)沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157:H7的快速檢測(cè)方法，該方法從樣品制備到出具檢測(cè)結(jié)果只需2 h。Yan Wenjing等[14]基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合主成分分析，開(kāi)發(fā)了一種能夠同時(shí)檢測(cè)6 種食源性致病菌的快速檢測(cè)方法，具有速度快、精度高的特點(diǎn)。這些方法雖然提高了檢測(cè)的靈敏度、縮短了檢測(cè)時(shí)間，但均需要光譜儀和質(zhì)譜儀等大型儀器設(shè)備，不便用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，急需開(kāi)發(fā)能夠擺脫大型儀器依賴的新型檢測(cè)手段。

酶促重組等溫?cái)U(kuò)增（enzymatic recombinase amplification，ERA）技術(shù)是近些年新研發(fā)的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[15-16]。該技術(shù)能夠在常溫環(huán)境下，依靠體系中的重組酶等組分，完成目標(biāo)核酸片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快、靈敏度高，且對(duì)儀器設(shè)備要求低，可在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下進(jìn)行操作。該技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于臨床診斷、腐敗菌檢測(cè)、動(dòng)物病毒檢測(cè)等諸多方面[16-18]，但應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)的研究較少，且多針對(duì)單一檢測(cè)對(duì)象。本研究針對(duì)嬰兒配方乳粉中易污染的克羅諾桿菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌4 種食源性致病菌，建立雙重ERA快速檢測(cè)方法，以期為嬰兒配方乳粉中致病菌的篩查提供快速檢測(cè)手段，同時(shí)也為其他食源性病原菌的檢測(cè)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用菌分別來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）、德國(guó)微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）、英國(guó)典型菌種保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC）和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫微生物菌種保藏管理中心（Inspection and Quarantine Culture Collection，IQCC），以上所有菌均保藏于IQCC。信息詳見(jiàn)表1。市售嬰兒配方乳粉樣品采購(gòu)于北京超市和電商。

腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHIB）培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養(yǎng)基、LB肉湯（LBB）培養(yǎng)基 英國(guó)Oxoid公司；PrepManTMUltra樣品制備試劑 美國(guó)Thermo Fisher公司；熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法） 蘇州先達(dá)基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico 17離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；D1008E掌上離心機(jī) 美國(guó)Scilogex公司；BioSpec-nano紫外-可見(jiàn)光分光光度儀 日本島津公司；VORTEX 3渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；3850V高壓滅菌鍋 以色列Tuttnauer公司；DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Memmert公司；HH-2水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠；mq-3164便攜式迷你qPCR儀 上海翊輝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物來(lái)源

從G e n B a n k 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）、莫金斯克羅諾桿菌（C.m u y t j e n s i i）、康帝蒙提克羅諾桿菌（C.c o n d i m e n t i）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis）和都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）以及其他近源食源性致病菌的外膜蛋白X（outer membrane protein X，ompX）基因序列，利用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)。以阪崎克羅諾桿菌ompX基因（登錄號(hào)：NZ_CP027107.1）為靶序列，在屬間保守區(qū)域和屬間差異性區(qū)域設(shè)計(jì)克羅諾桿菌ERA引物探針。沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球的引物探針引自文獻(xiàn)[19-21]報(bào)道，此時(shí)探針的熒光標(biāo)記統(tǒng)一為FAM，通過(guò)比較擴(kuò)增效果進(jìn)行篩選。對(duì)篩選的探針序列進(jìn)行不同熒光標(biāo)記，序列及來(lái)源信息詳見(jiàn)表2，均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3.2 菌分離培養(yǎng)及基因組DNA提取

蘸取菌液在BHIA培養(yǎng)基表面劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落加入到5 mL的BHIB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中16 000×g離心2 min，棄上清液后加入100 μL PrepManTMUltra進(jìn)行DNA提取，渦旋振蕩混勻，100 ℃加熱5 min，16 000×g離心2 min，取50 μL上清液即為DNA模板，測(cè)其濃度后于-20 ℃保存[23]。

1.3.3 反應(yīng)體系與檢測(cè)程序

ERA熒光法反應(yīng)體系參照熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）使用說(shuō)明書(shū)制備預(yù)混液，取混勻后的預(yù)混液47 μL至ERA酶粉反應(yīng)管，模板量均為1 μL，向管蓋滴加2 μL激活劑，蓋緊后渦旋瞬時(shí)離心，放入便攜式迷你qPCR儀進(jìn)行ERA反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)榈?階段39 ℃、1 s；第2階段39 ℃、14 s，共40 個(gè)循環(huán)，第2階段進(jìn)行熒光信號(hào)收集。FAM熒光通道檢測(cè)對(duì)象為克羅諾桿菌、HEX熒光通道檢測(cè)對(duì)象為沙門(mén)氏菌、ROX熒光通道檢測(cè)對(duì)象為金黃色葡萄球菌、Cy5熒光通道檢測(cè)對(duì)象為單核細(xì)胞增生李斯特菌。

1.3.4 引物探針篩選

分別以表1所列的克羅諾桿菌屬細(xì)菌、沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌以及金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，分析相關(guān)文獻(xiàn)中[20-27]引物探針的擴(kuò)增效率和屬內(nèi)覆蓋度，確定最優(yōu)引物探針。然后對(duì)篩選的引物探針進(jìn)行特異性分析，分別以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544、單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708、金黃色葡萄球菌CMCC26003的基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以非靶標(biāo)菌基因組DNA為陰性對(duì)照，以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照進(jìn)行ERA反應(yīng)。所有樣品的基因組DNA質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，每次實(shí)驗(yàn)2 個(gè)平行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.5 雙重ERA檢測(cè)方法的建立

分別將克羅諾桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的引物探針兩兩組合，混合加入同一反應(yīng)體系，基因組DNA模板加量為10 ng/μL，以無(wú)菌ddH2O為陰性對(duì)照，分析引物探針的交叉反應(yīng)性，確定雙重反應(yīng)的最優(yōu)組合方式。

1.3.6 雙重ERA檢測(cè)方法反應(yīng)體系優(yōu)化

1）引物濃度優(yōu)化：將ERA反應(yīng)預(yù)混液中每種引物（濃度均為10 μmol/L）的體積分別調(diào)整為1.5、2、2.5、3、3.5、4 μL，分別以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544和單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708和金黃色葡萄球菌CMCC26003的基因組DNA為模板進(jìn)行ERA反應(yīng)，每種菌基因組DNA質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，根據(jù)擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度確定雙重ERA檢測(cè)反應(yīng)的最佳引物濃度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)2 個(gè)平行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

2）探針濃度優(yōu)化：引物體積按照上述的優(yōu)化結(jié)果，將探針（濃度均為10 μmol/L）體積分別調(diào)整為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μL，分別以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544和單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708和金黃色葡萄球菌CMCC26003的基因組DNA為模板進(jìn)行ERA反應(yīng)，基因組DNA質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，根據(jù)擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度確定雙重ERA檢測(cè)反應(yīng)最佳的探針濃度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)2 個(gè)平行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.7 雙重ERA檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)

為進(jìn)一步分析建立的雙重ERA檢測(cè)方法的靈敏度，將模板DNA濃度分別稀釋為101、100、10-1、10-2ng/μL，采用1.3.6節(jié)確定的ERA反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析雙重ERA檢測(cè)的靈敏度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)2 個(gè)平行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.8 雙重ERA檢測(cè)方法人工污染樣品

取單菌落加入至10 mL離心管中，37 ℃培養(yǎng)48 h使細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用的種子液。將種子液以1%接種量接入LBB培養(yǎng)基，37 ℃增菌培養(yǎng)12 h，梯度稀釋后通過(guò)平板計(jì)數(shù)法對(duì)生長(zhǎng)量進(jìn)行測(cè)算，確定4 種細(xì)菌在這一培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)量。按上述操作重新培養(yǎng)菌液12 h，根據(jù)生長(zhǎng)量計(jì)算，使用無(wú)菌水稀釋至100 CFU/mL。

稱取25 g嬰兒配方乳粉為基質(zhì)，加入225 mL LBB培養(yǎng)基制成均質(zhì)液。向均質(zhì)液中分別添加2.25 mL上述100 CFU/mL的阪崎克羅諾桿菌ATCC29544和單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC15313、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708和金黃色葡萄球菌CMCC26003菌液，即每種菌的污染量為1 CFU/mL，37 ℃增菌培養(yǎng)2、4、6 h后按1.3.7節(jié)方法提取基因組DNA。分析人工污染樣品的檢出限。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.9 市售樣品檢測(cè)

購(gòu)買的17 份嬰兒配方乳粉，按1.3.8節(jié)方法取樣均質(zhì)后增菌培養(yǎng)12 h，采用1.3.2節(jié)方法進(jìn)行基因組DNA提取。分別以中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1870—2016《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[28]、SN/T 1059.7—2010《進(jìn)出口食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[29]和SN/T 5224—2019《出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)標(biāo)法》[30]規(guī)定的實(shí)時(shí)熒光PCR法和雙重ERA法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果分析建立的雙重ERA法的檢測(cè)效果，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種病原菌ERA檢測(cè)引物探針篩選

根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）和ERA在原理上有一定的相似性，通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌有RAA或RPA檢測(cè)引物探針。因此對(duì)文獻(xiàn)中已報(bào)道的4 組沙門(mén)氏菌、4 組單核細(xì)胞增生李斯特菌、1 組金黃色葡萄球菌以及本研究設(shè)計(jì)的3 組克羅諾桿菌引物探針進(jìn)行ERA檢測(cè)效果分析。結(jié)果顯示，本研究設(shè)計(jì)的AF2-1/AR2-1/AP2引物探針組合對(duì)克羅諾桿菌具有良好的擴(kuò)增效率，且對(duì)屬內(nèi)菌株：阪崎克羅諾桿菌ATCC29544、莫金斯克羅諾桿菌ATCC51329、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌DSM18702、都柏林克羅諾桿菌DSM18705、尤尼沃斯克羅諾桿菌NCTC9529的覆蓋性良好（圖1A）。文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道的引物探針?lè)謩e對(duì)沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌具有良好的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增曲線均為光滑明顯的S型曲線，空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，且對(duì)屬內(nèi)菌株的覆蓋性良好（圖1B～D）。優(yōu)選的引物探針詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

圖1 4 種菌ERA引物探針篩選結(jié)果Fig.1 Results of screening of ERA probes for four pathogenic bacteria

2.2 4 種病原菌ERA引物探針特異性分析

為進(jìn)一步分析篩選的4 種病原菌的引物探針特異性，分別對(duì)其進(jìn)行ERA檢測(cè)分析，結(jié)果如圖2所示，4 種引物探針組合均只對(duì)特定的陽(yáng)性靶標(biāo)菌有良好的擴(kuò)增，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等13 種其他菌株（表1編號(hào)23～35）均無(wú)擴(kuò)增，同時(shí)在4 種食源性致病菌之間均未出現(xiàn)交叉擴(kuò)增，證明本研究選用的4 種引物探針組合特異性良好，可以用于沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和克羅諾桿菌的ERA快速檢測(cè)。

圖2 4 種菌ERA引物探針特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specificity of ERA probes for four pathogenic bacteria

2.3 雙重ERA檢測(cè)體系優(yōu)化

對(duì)4 種菌引物探針互相組合的雙重ERA檢測(cè)結(jié)果分析，最后選定克羅諾桿菌與單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌兩套雙重ERA檢測(cè)體系。進(jìn)一步對(duì)上述兩套雙重ERA檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化。如圖3所示，克羅諾桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌雙重ERA檢測(cè)體系中每種引物的最佳用量為1.5 μL、每種探針的最佳用量為0.5 μL（圖3A、C）；在沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌雙重ERA檢測(cè)體系中，金黃色葡萄球菌的最佳引物探針用量分別為3.5 μL和0.6 μL，而沙門(mén)氏菌的最佳引物與探針用量為4 μL和0.8 μL。由于沙門(mén)氏菌的熒光信號(hào)強(qiáng)度不如金黃色葡萄球菌高，因此，選擇沙門(mén)氏菌的最佳引物與探針用量作為該雙重ERA檢測(cè)體系的引物探針用量（圖3B、D）。

圖3 雙重ERA檢測(cè)體系優(yōu)化Fig.3 Results of optimization of dual-ERA systems

2.4 雙重ERA檢測(cè)方法靈敏度分析

對(duì)提取的DNA質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，C.sakazakiiATCC29544為208.56 ng/μL、S.entericaATCC10708為512.7 ng/μL、L.monocytogenesATCC15313為145.24 ng/μL、S.aureusCMCC26003為239.9 ng/μL。在此基礎(chǔ)上，將克羅諾桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的DNA兩兩混合，使體系中每種菌DNA質(zhì)量濃度分別為101、100、10-1、10-2ng/μL。采用優(yōu)化的雙重ERA檢測(cè)體系，進(jìn)一步分析對(duì)4 種致病菌檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果顯示，本研究建立的雙重ERA檢測(cè)方法對(duì)沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的靈敏度較高，DNA質(zhì)量濃度為10-2ng/μL時(shí)仍能檢出；對(duì)克羅諾桿菌檢測(cè)的靈敏度相對(duì)較低，最低檢出質(zhì)量濃度為1 ng/μL（圖4）。

圖4 雙重ERA檢測(cè)方法靈敏度分析結(jié)果Fig.4 Sensitivity of dual-ERA method

2.5 人工污染實(shí)驗(yàn)

對(duì)人工污染的嬰兒配方乳粉樣品進(jìn)行增菌處理并提取基因組DNA，采用本研究建立的雙重ERA方法進(jìn)行檢測(cè)。表3顯示，增菌培養(yǎng)6 h后，最低可檢出污染量為1 CFU/mL的4 種菌。

表3 人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of detection of artificially contaminated samples

2.6 市售樣品檢測(cè)

采用本研究建立的雙重ERA檢測(cè)方法對(duì)市售的17 份嬰兒配方乳粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，并以標(biāo)準(zhǔn)[29-31]規(guī)定的4 種食源性致病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。結(jié)果顯示，17 種乳粉樣品均未檢測(cè)出克羅諾桿菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌；嬰兒配方牛乳粉和嬰兒配方羊乳粉各有一個(gè)樣品檢測(cè)出金黃色葡萄球菌，檢出率為11.76%，且雙重ERA檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果一致（表4）。證實(shí)了本研究建立的克羅諾桿菌、沙門(mén)氏菌、單核李斯特菌和金黃色葡萄球菌雙重ERA檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detection of actual samples

3 討 論

乳粉污染食源性致病菌的案例在國(guó)內(nèi)外仍時(shí)有發(fā)生。然而，現(xiàn)有的檢測(cè)方法存在一些不足，如培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)、需要豐富的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)、對(duì)大型儀器設(shè)備依賴度高等。因此，開(kāi)發(fā)耗時(shí)短、易操作、不依賴大型儀器的嬰兒配方乳粉中食源性致病菌快速檢測(cè)方法是十分必要的。ERA技術(shù)是近些年研發(fā)的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在無(wú)需變溫?cái)U(kuò)增設(shè)備的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間和檢測(cè)靈敏度。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有利用ERA技術(shù)進(jìn)行食源性病原菌檢測(cè)的報(bào)道。克羅諾桿菌是國(guó)標(biāo)規(guī)定的嬰兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品嚴(yán)格不能檢出的病原菌[31]，因此本研究以克羅諾桿菌ompX基因?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)了ERA引物和探針。OmpX是存在于革蘭氏陰性菌外膜上的一類蛋白質(zhì)，是介導(dǎo)克羅諾桿菌黏附在小腸絨毛細(xì)胞表面的關(guān)鍵蛋白[32]，但目前作為PCR檢測(cè)靶點(diǎn)的研究較少。本研究以克羅諾桿菌ompX基因靶點(diǎn)建立了ERA可視化快速檢測(cè)方法。并創(chuàng)新性地將RAA和RPA檢測(cè)體系平移到ERA檢測(cè)體系中，通過(guò)比較文獻(xiàn)報(bào)道的沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌RPA/RAA引物探針在ERA檢測(cè)體系中的檢測(cè)效果，確定了這3 種菌在ERA檢測(cè)體系中最優(yōu)的引物探針。并與本研究篩選的克羅諾桿菌ERA引物和探針結(jié)合，構(gòu)建了克羅諾桿菌-單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌-金黃色葡萄球菌兩套雙重ERA快速檢測(cè)方法，從而提高了檢測(cè)通量，減少了擴(kuò)增時(shí)間，也節(jié)省了檢測(cè)成本。

同時(shí)，結(jié)合課題組前期已開(kāi)發(fā)的用自發(fā)熱包提取病原菌基因組DNA的方法，依托合作研發(fā)的4通道便攜式迷你qPCR儀（僅一個(gè)平板電腦大小，4 種熒光通道），可在20 min左右完成樣品DNA提取、ERA檢測(cè)和出具檢測(cè)報(bào)告，從而在不依賴實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)食品中致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的目的。且本研究最低可前增菌6 h，即可實(shí)現(xiàn)1 CFU/mL的檢出限，與采用前增菌18～22 h的其他方法一致，說(shuō)明該方法的靈敏度較高。本研究對(duì)這4 種食源性致病菌雙重ERA檢測(cè)只是一個(gè)概念驗(yàn)證項(xiàng)目，只需替換引物探針序列就可以實(shí)現(xiàn)其他靶標(biāo)的檢測(cè)。為食品、臨床、環(huán)境等其他領(lǐng)域的研究提供了新的檢測(cè)思路。

4 結(jié) 論

本研究基于ERA技術(shù)，針對(duì)嬰兒配方乳粉中易污染的4 種食源性致病菌，建立了克羅諾桿菌-單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌-金黃色葡萄球菌兩套雙重ERA檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了DNA提取＋檢測(cè)結(jié)果＋出具報(bào)告僅需20 min左右即可完成4 種致病菌快速檢測(cè)的目的。且對(duì)沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的檢出限為10-2ng/μL，對(duì)克羅諾桿菌純培養(yǎng)物的檢出限為1 ng/μL，前增菌6 h，樣品中致病菌檢出限可達(dá)1 CFU/mL，具有特異性好、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需變溫設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，可用于嬰兒配方乳粉中食源性致病菌的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。