油莎豆膳食纖維對短鏈脂肪酸生產能力和腸道菌群分布特征影響

王玲玉，閆春梅，賈 夢，黃 璟，王安琪，汪軒羽，王新濤，李秀荷，王慧芳，戴福宏，李 寧，周中凱,*，高鐵成,*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.新疆三禮糧油有限公司，新疆 圖木舒克 843900；4.廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400）

油莎豆（Cyperus esculentus）又稱虎皮果、地下板栗、地下核桃等，目前主要種植于我國的北部和中部地區，是一種優質、高產、經濟效益和生態效益兼備的作物[1-2]。油莎豆中除含有豐富的脂肪（22.14%～44.92%）和淀粉（23.21%～48.12%）外，還含有大量的膳食纖維（8.26%～15.47%），且高于其他普通塊莖植物，通常用于制備食用油、淀粉和豆奶飲料等[3]。先前研究表明，油莎豆豆乳在加工過程中產生的固體廢料中膳食纖維含量高達59.71%，主要由不溶性膳食纖維組成，且與其他膳食纖維相比具有更強的持水、持油能力，可作為一種潛在的功能性食品[4]。因此，對油莎豆膳食纖維的開發和利用具有重要的經濟價值。

膳食纖維是一種不能被胃和小腸消化吸收的碳水化合物，通常需到達大腸被結腸微生物部分或完全降解[5]。研究報道，腸道微生物可利用膳食纖維產生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）（乙酸、丙酸和丁酸），促進腸道微生物群中特定和有益細菌群的生長，并通過競爭營養素和黏附位點來防止病原體的潛在定植，降低結腸相關疾病以及一些代謝綜合征的風險，如肥胖、糖尿病、慢性腎病和全身炎癥[5-7]。Yao Wanzi等[8]探究了米糠和麥麩中膳食纖維對腸道微生物的作用，結果表明膳食纖維可調節腸道菌群的生長（Lactobacillus、Bifidobacterium、Enterobacter），并促進SCFAs的產生維持宿主健康。夏潔[9]發現刺梨中不溶性膳食纖維顯著促進乙酸的產生，并降低厚壁菌門與擬桿菌門的比例。此外，武明月等[10]探究大豆膳食纖維對小鼠腸道菌群的影響，結果表明大豆膳食纖維可增加阿克曼氏菌屬和糞桿菌屬豐度，并顯著增加了小鼠結腸內SCFAs含量。同時，Wang Yong等[11]的研究也發現富含膳食纖維的谷物如燕麥及苦蕎的攝入可增加腸道微生物Lactobacillus和Romboutsia的豐度，并伴隨著SCFAs尤其是丁酸在結腸中的高水平合成。

目前，油莎豆作為一種新型油料作物，大多研究主要集中于油脂及淀粉，其膳食纖維在人體內的有益作用鮮見報道，本研究采用體外結腸發酵技術，通過16S rRNA高通量測序，并以大豆膳食纖維為對照，探究油莎豆中膳食纖維對人體腸道菌群的作用及對短鏈脂肪酸產生的影響，為油莎豆的綜合利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆膳食纖維為國內生產的商業化產品；油莎豆粕新疆三禮糧油有限公司；耐高溫α-淀粉酶、水解蛋白酶和葡萄糖轉苷酶，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸標準品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白胨、酵母膏、L-半胱氨酸鹽、膽鹽、VK1、吐溫-80、氯高鐵血紅素 北京奧博星生物有限公司；其他普通化學試劑購于天津江天化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱上海博訊實業有限公司；TS-110XS水浴搖床 上海科辰實驗設備有限公司；YQX-II厭氧培養箱 上海溪乾儀器設備有限公司；GI54TW立式自動壓力蒸汽滅菌器上海馳通儀器有限公司；GC-2014氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆膳食纖維的提取

參照郭蕓[12]的方法并略作修改。準確稱取5 g油莎豆粉，用石油醚洗滌2 次，將烘干后的樣品與磷酸鹽緩沖溶液（pH 6）混合均勻，加入耐高溫α-淀粉酶在95 ℃攪拌1 h，冷卻至60 ℃后調節pH值為4.5，然后加入水解蛋白酶60 ℃水浴1 h，調節pH值至4.2，最后加入葡萄糖轉苷酶，水浴1 h后滅酶30 min。將樣品離心20 min，沉淀分別用75%乙醇和丙酮洗滌2 次，真空抽濾，將烘干后樣品磨成粉過100 目篩，即油莎豆膳食纖維。

1.3.2 體外模擬腸道微生物發酵過程

采用新鮮人體糞便作為腸道微生物來源，對膳食纖維進行體外發酵研究[13]。收集5 名健康志愿者（3 名男性和2 名女性）的糞便，要求志愿者在近3 個月未服用抗生素，且無腸道疾病。取等量的糞便樣品混合均勻，用0.1 mol/L pH 7.2的無菌磷酸鹽緩沖液稀釋至25%，均質后，用4 層無菌紗布過濾，將濾液與培養基按照1∶4的比例進行混合，作為發酵液。膳食纖維的添加量為1%和2%，其中油莎豆膳食纖維記為Y1、Y2，大豆膳食纖維記為D1、D2。以不添加膳食纖維樣品的糞便液為空白對照，分別取發酵點0 h和24 h的樣品，對應標記為CK0和CK24。樣品在37 ℃進行厭氧發酵，并在0、12 h和24 h取樣測定發酵液中SCFAs和腸道微生物的變化。

基礎培養基由蛋白胨（2 g/L）、酵母提取物（2 g/L）、NaCl（0.1 g/L）、K2HPO4（0.04 g/L）、KH2PO4（0.04 g/L）、MgSO4·7H2O（0.01 g/L）、NaHCO3（2 g/L）、C a C l2·6 H2O（0.0 1 g/L）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（0.5 g/L）、膽汁鹽（0.5 g/L）、VK1（10 μL/L）、吐溫80（2 mL/L）和血紅素（50 mg/L）組成。

1.3.3 SCFAs含量的測定

參照Wang Anqi等[14]的方法。取500 μL上清液于2 mL離心管中，加入10% H2SO4渦旋30 s調節pH值至2～3，然后加入800 μL乙醚，渦旋30 s后，離心20 min（4 ℃、10 000 r/min），上清液用0.22 μm濾膜過濾后測定SCFAs含量。其中進樣量為1 μL，分流比20∶1；載氣為氮氣，流量為2 mL/min；升溫程序如下：在140 ℃保持3 min，然后以6 ℃/min的速率增加到190 ℃維持15 min。使用乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸的標準混合物確定SCFAs的含量。

1.3.4 微生物16S rRNA基因測序

在Illumina NovaSeq測序平臺上構建高通量測序文庫并進行配對端測序。從糞便樣品中提取DNA后，通過PCR擴增，熒光定量和NovaSeq PE250測序，在97%的序列相似度水平上，對所有序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類，并進行物種注釋及豐度分析；通過α多樣性、β多樣性分析以及主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），對樣本微生物群落組成差異性進行分析。

1.4 數據處理及分析

采用Origin對原始數據進行整理，采用SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析，結果用±s表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 膳食纖維對腸道微生物產SCFAs的影響

腸道微生物可作用于未消化的碳水化合物產生SCFAs，其中膳食纖維發酵產生的SCFAs被認為是結腸的主要營養和能量來源，可為結腸細胞提供能量，降低結腸中pH值、抑制病原體、維持腸道屏障的完整性[5]。由圖1可得，乙酸、丙酸和丁酸是腸道微生物產生的主要SCFAs。與空白相比，膳食纖維的加入可顯著增加總SCFAs的含量，其中大豆膳食纖維產生的SCFAs顯著高于油莎豆。研究表明，大豆膳食纖維產生的乙酸、丙酸和丁酸含量比燕麥麩皮、玉米麩皮或麥麩纖維多1.5～8.0 倍[10]。膳食纖維一般分為可溶性纖維和不溶性纖維，相比于大豆膳食纖維，油莎豆不溶性膳食纖維含量較高，發酵程度較慢，不易被微生物降解，這可能是油莎豆產酸能力較弱的原因[15]。由圖1可知，經腸道微生物發酵后，與空白組（CK24）相比，膳食纖維組在發酵24 h后，其乙酸質量濃度增加了0.16～0.34 mg/mL，乙酸是人體腸道中含量較高的SCFAs，約占60%左右，不僅為肝臟和周圍組織提供能量，而且在糖異生和脂肪生成中發揮重要作用[16]。丙酸是膳食纖維發酵后變化較大的SCFAs，發酵24 h后，其質量濃度增加了0.12～0.56 mg/mL，丙酸能降低肝臟和血漿中脂肪酸的含量，抑制膽固醇的合成，在減少食物誘導的腸道激素方面發揮重要作用[17]。此外，膳食纖維可顯著促進腸道微生物中丁酸的含量，發酵24 h后，其質量濃度增加了0.09～0.41 mg/mL，丁酸可以作為結腸上皮細胞的能量來源，提供大約60%～70%的總能量需求，這有助于預防結腸癌，減少細菌移位和炎癥，并改善屏障功能[18-20]。研究表明大豆膳食纖維和麥麩膳食纖維可顯著增加乙酸、丙酸和丁酸含量，這與本研究結果一致[10,21]。同時，由圖1可知，相比于大豆膳食纖維，油莎豆膳食纖維在發酵后期其產酸速率顯著低于大豆，研究表明化學結構和物理形態是影響發酵速度、SCFAs產生和微生物生長的關鍵因素，包括糖苷鍵組成、分子質量、分子排列水平和粒徑等[22]。

圖1 發酵過程中SCFAs的變化Fig.1 Production of SCFAs during fermentation

2.2 腸道微生物多樣性分析

2.2.1 OTU數及α多樣性分析

人類腸道微生物在長期競爭和進化過程中與宿主相互依賴，并在健康、營養、代謝特性和免疫穩態中發揮關鍵作用[23]。采用16S rRNA高通量測序技術，研究膳食纖維對腸道微生物的影響，不同樣品的注釋情況如圖2所示。圖2A由各樣品中總OTU數所繪制，重疊部分代表不同樣品中共有的OTU數，共521 個，且相比于空白組，添加膳食纖維的發酵液中的OTU數發生顯著變化，各樣品中獨有的OTU分別為76、58、31和136。其中添加量為2%的油莎豆膳食纖維中特有的OTU最多，表明高濃度的油莎豆膳食纖維可顯著改變腸道菌群的組成。

圖2 腸道菌群Venn圖（A）和α多樣性指數（B）Fig.2 Venn diagram (A) and α-diversity indexes (B) of gut microbiota

α多樣性通常代表腸道微生物的多樣性，結果如圖2B所示，ACE指數和Chao1指數代表菌落豐富度，Shannon指數和Simpson指數代表菌落多樣性[18]。發酵24 h后，相比于空白組，添加量為1%的油莎豆膳食纖維組中ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數無顯著變化，而添加量為2%時，其α多樣性指數均顯著降低，大豆膳食纖維的發酵也體現出同樣特征，呈現出腸道微生物多樣性與膳食纖維干預劑量的依賴性，這可能表明在發酵過程中因為豐富膳食纖維的存在，導致代謝行為的旺盛，從而抑制了某些微生物的生長。

2.2.2β多樣性分析

β多樣性是對不同樣本中微生物群落構成相似度進行比較分析。本研究基于Weighted Unifrac距離和Unweighted Unifrac距離進行PCoA，并選取貢獻率最大的主坐標組合進行分析，具有高度相似的群落結構的樣本聚集在一起，而群落差異很大的樣本則會顯著分離。由圖3可得，發酵24 h后，發酵液中的腸道菌群發生顯著變化，其中空白組與樣品組彼此分離，表明膳食纖維的加入可改善腸道菌群結構。此外，添加1%的樣品組與空白組距離較近，而與2%樣品組的距離較遠，表明高濃度的膳食纖維能明顯地改變腸道菌群結構，這與α多樣性結果一致。此外，油莎豆和大豆膳食纖維2 組樣品彼此分離且距離較遠，表明這2 種膳食纖維對腸道菌群發揮著不同的作用，這可能與各自結構有關，其中大豆膳食纖維含有較高的可溶性組分，具有快速的發酵動力學特征；而油莎豆膳食纖維是以不溶性膳食纖維為主成分，腸道菌群對其利用速率較低，從而導致2 種膳食纖維對腸道菌群的多樣性產生不同影響。

圖3 腸道微生物PCoAFig.3 PCoA plots of gut microbiota

2.3 腸道微生物菌落結構分析

通過對門水平微生物群落結構進行分析，結果表明厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是樣品中的優勢菌群，和先前所報道的人體腸道微生物菌群組成[18]一致。由圖4可知，除添加量為2%的大豆膳食纖維外，膳食纖維的添加均可增加厚壁菌門和放線菌門的相對豐度，同時降低擬桿菌門的豐度，這與王勇[19]及Dewulf[24]等的研究結果一致。此外，油莎豆樣品組中厚壁菌門的相對豐度高于大豆組，許多可以利用碳水化合物的微生物，包括益生菌乳酸菌，都屬于厚壁菌門，其豐度的增加通常與發酵底物有關，且研究表明高纖維飲食可促進小鼠體內厚壁菌門的增加[25]。擬桿菌中含有多種碳水化合物活性酶，以產乙酸和丙酸為主，可專門降解和利用多糖[17]。在本研究中添加量為2%的大豆膳食纖維顯著促進了擬桿菌門的生長，且厚壁菌門/擬桿菌門的比值顯著降低。先前研究通常用厚壁菌門/擬桿菌門的比值用來衡量腸道微生物菌群是否出現生態失調，其比值降低可減少能量的吸收，降低肥胖風險，然而也有研究表明兩者的比值并不是確定肥胖的確切指標[26]。此外，添加量為2%的油莎豆膳食纖維增加了變形菌門的相對豐度，同時由屬水平結構可得主要為大腸桿菌，先前研究表明，大腸桿菌對人體的健康存在雙重效應，在某些情況下，大腸桿菌的缺失可造成疾病的發生[27-28]。同時，由圖4可知，油莎豆膳食纖維可顯著增加放線菌門的相對豐度，而大豆膳食纖維無顯著變化。放線菌是一類可以產生抗菌素和酶的微生物，其主要優勢菌是雙歧桿菌，在調節腸道健康方面發揮重要作用。Dominianni等[29]的研究證明大豆、蔬菜、水果中的膳食纖維均能夠增加放線菌的豐度，對胃腸道乃至整個機體的健康有重要意義。

圖4 門水平（A）和屬水平（B）微生物組成Fig.4 Composition of microbial community at phylum (A) and genus (B) levels

選取屬水平豐度前30的微生物進行分析，如圖4、5所示。結果表明，膳食纖維的添加對腸道菌群的組成產生一定影響。大豆纖維膳食顯著增加了普雷沃菌屬（Prevotella）的相對豐度，而油莎豆膳食纖維降低了該菌的相對豐度。普雷沃菌屬是腸道發酵中的重要微生物，可分解木聚糖和其他的植物纖維產生SCFAs，研究表明靈芝中膳食纖維可促使Prevotella豐度的降低，降低了血清胰島素抵抗水平[26,30]。由圖4可知，膳食纖維的添加降低了擬桿菌屬（Bacteroides）的相對豐度，尤其是油莎豆膳食纖維分別降低了7%和14%。擬桿菌屬是一種革蘭氏陰性菌，長期寄居在人體腸道中，是引起腸道疾病的常見微生物，其富集會引發炎癥反應和糖尿病[31]。此外，油莎豆膳食纖維可顯著增加罕見小球菌屬（Subdoligranulum）的相對豐度，Subdoligranulum是近年來在人體糞便中新發現的球菌屬，廣泛存在于健康人體內，可降低機體炎癥水平、增強腸胃動力，并控制血糖水平[32]。由圖5可知，與空白組CK24對比，油莎豆膳食纖維組可顯著增加雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對豐度，且添加量越高其豐度越高。此外，乳桿菌（Lactobacillus）在低濃度下的膳食纖維發酵液中顯著增加，且油莎豆膳食纖維中的豐度高于大豆。雙歧桿菌和乳酸菌是腸道內重要的益生菌，已被證明能降低腸道脂多糖的合成，增強腸道屏障功能，降低炎癥和肥胖發生的風險[5]。先前多項研究發現，谷物、豆渣、紅棗、香蕉等食物中的膳食纖維均能夠促進雙歧桿菌和乳桿菌的增殖[19,33]。丁酸的產生通常與瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和糞桿菌屬（Faecalibacterium）呈顯著正相關[5]。在本研究中，高濃度的膳食纖維可顯著增加這2 種菌屬的相對豐度，且油莎豆中其相對豐度顯著高于大豆，表明油莎豆膳食纖維具有更強的促進有益菌生長的能力。

圖5 腸道菌群豐度熱圖分析（屬水平）Fig.5 Heatmap of the relative abundance of intestinal microbiota (at genus level)

綜上所述，通過對腸道微生物的分析，結果表明膳食纖維在低濃度時對腸道菌群的影響較小，而在高濃度時可顯著改變腸道菌群的多樣性和豐富度，同時2 種膳食纖維對腸道菌群的作用各不相同；在微生物門水平上，油莎豆膳食纖維的添加促進了厚壁菌、放線菌和變形菌的生長，而抑制了擬桿菌門的豐度；屬水平結果顯示，相比于大豆膳食纖維，油莎豆膳食纖維的添加可顯著增加罕見小球菌屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌、瘤胃球菌屬和糞桿菌屬的相對豐度，但普雷沃菌屬和擬桿菌屬被顯著抑制。

3 結 論

利用體外結腸發酵技術，以大豆膳食纖維為對照，探究油莎豆中膳食纖維對腸道微生物的影響。結果表明：油莎豆膳食纖維可顯著促進SCFAs的產生，但產酸量弱于大豆膳食纖維，且隨著添加量的增加，其產酸能力增強；添加量為1%的膳食纖維對腸道菌群的多樣性和豐富度無顯著影響，而在高濃度時可顯著改變腸道菌群結構，且2 種膳食纖維對菌群結構的影響具有顯著差異；在高濃度時，添加油莎豆膳食纖維可顯著增加厚壁菌門、變形菌門和放線菌門的相對豐度，而降低了擬桿菌門的豐度，且與大豆膳食纖維對門水平腸道菌群作用相反；此外，與大豆膳食纖維相比，油莎豆膳食纖維促進雙歧桿菌屬、乳桿菌、瘤胃球菌屬、糞桿菌屬和罕見小球菌屬生長繁殖的能力更強，同時顯著降低了普雷沃菌屬和擬桿菌屬的相對豐度。以上結果表明，膳食纖維可促進SCFAs的產生，并調節腸道微生物菌群結構，但不同來源的膳食纖維對腸道菌群的作用有所差異，本研究為油莎豆膳食纖維在功能性食品的應用提供了理論依據。