溫度響應的黃曲霉毒素B1納米抗體重組表達、復性及生物活性

張樂平，涂 追*，李燕萍3，李小江，帥文苑，張 航，何慶華3

（1.南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047；3.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047）

類彈性蛋白多肽（elastin-like polypeptide，ELP）是一種利用基因工程方法人工合成的蛋白質聚合物，具有良好的生物相容性[1-2]。ELP由n個重復氨基酸序列“V-PG-X-G”組成，其中殘基“X”可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸。當溫度高于相變溫度時，ELP具有從可溶狀態向沉淀狀態轉變的能力[3-4]。除溫度外，一定濃度的鹽離子、pH值也可以誘發ELP的相變[5]。當溫度降低、鹽離子濃度降低或在其他刺激作用存在時，ELP的相變可逆[6]。在過去的20年里，已有使用ELP標簽純化蛋白質的各種方法。早在1999年，Meyer等[7]就將ELP與蛋白質融合，利用可逆相變循環（inverse transition cycling，ITC）使其從復雜混合物中分離出來，再利用蛋白酶將ELP標簽切除掉。Shi Changhua等[8]開發了一種基于內含子剪接與雙ELP標簽的新型蛋白質純化平臺，純化得到了4 種不同分子質量大小的目的蛋白。Coolbaugh等[9]將自切割內含子與ELP標簽結合，于微滴定孔板中純化了綠色熒光蛋白與半乳糖苷酶，開發了高通量純化蛋白的親和沉淀法。Fan Yamin等[10]使用分裂內含子與ELP標簽，實現了目的蛋白與純化標簽間的受控切割。除此以外，利用親和配體與ELP融合表達，可用于捕獲和沉淀所需要的產物，避開隨后從產物中切割ELP標簽的步驟。Swartz等[11]將蛋白A的Z結構域與ELP標簽融合表達，用于純化單克隆抗體。Kostal等[12]利用細菌金屬調節蛋白對DNA的特異親和性以及ELP蛋白的相變特性實現了質粒DNA純化。然而，ELP作為融合標簽在蛋白純化方面的應用廣泛，卻鮮少見于小分子的純化處理。

真菌毒素是食品中常見的小分子污染物，其種類繁多、毒性強、不易降解，對人體健康存在著極大威脅。日常生活中的食品種類極多、成分復雜，真菌毒素含量通常又極低，使用分析儀器直接定量檢測很難實現，對食品樣品進行前處理以實現對目標檢測物的富集純化有助于提高檢測靈敏度[13]。目前，各類食品中真菌毒素樣品前處理的方法主要有液相萃取法[14]、固相萃取法[15]、磁顆粒輔助提取法[16]、超聲輔助提取法[17]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法[18]、免疫親和柱法[19]等。其中，免疫親和柱法雖然具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優點，也是國家標準中規定的黃曲霉毒素提取方法，卻存在制作工藝復雜、成本高昂、污染環境等問題。

為了解決免疫親和柱制備過程中抗體偶聯的不可控性，降低成本，建立環境友好型的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）純化新方法，本研究構建納米抗體與不同長度ELP融合表達的重組載體，將轉化大腸桿菌表達后的4 種蛋白分別以稀釋復性、ITC純化、透析復性、柱上復性的方式進行復性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析4 種復性方式得到4 種蛋白純度與含量，間接競爭酶聯免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）測定其IC50差異，相對濁度分析測定其相變溫度，圓二色譜分析其二級結構組成。旨在為后續建立以納米抗體作為識別單元的可控相變生物純化介質，用于AFB1檢測樣品前處理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主菌大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、表達載體pET30a-G8-GFP由本實驗室保存；載體pUC57-ELP10由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

限制性內切酶（EcoRI、DraIII、BglI）、T4-DNA連接酶 紐英倫生物技術（北京）公司；限制性內切酶（SfiI、NotI）、rTaqDNA聚合酶、dNTP 寶日醫生物技術（北京）有限公司；尿素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、精氨酸、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺單組分顯色液 索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Nanodrop1000微量分光光度計、多功能讀數儀、低溫高速離心機 賽默飛世爾上海（儀器）有限公司；SDS-PAGE電泳儀、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；CT62A全自動滅菌鍋 馳通儀器（上海）有限公司；JY92-IIDN超聲破碎儀 寧波新藝超聲設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 G8-ELP20、G8-ELP40、G8-ELP60、G8-ELP80融合表達載體的構建

退火寡核苷酸單鏈引物H1-F和H1-R見表1，退火條件設定為：95 ℃變性2 min；95 ℃降溫到25 ℃，每8 s降低0.1 ℃，共設置700 個循環；4 ℃冷卻10 min；以SfiI和NotI雙酶切pET30a-G8-GFP載體，與退火寡核苷酸片段進行連接，得到改造后的重組載體pET30a-G8（R）。

表1 載體構建相關引物序列Table 1 Primer sequences used for vector construction

ELP重復片段的連接通過遞歸定向連接法[20]實現，實驗原理如圖1所示。以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP10載體，回收較長片段，同時以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP10載體，回收較短片段，16 ℃過夜連接得到重組載體pUC57-ELP20；以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP20載體，回收較長片段，同時以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP20載體，回收較短片段，連接后得到重組載體pUC57-ELP40；以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP40載體，回收較長片段，同時以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP20載體，回收較短片段，連接后得到重組載體pUC57-ELP60；以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP40載體，回收較長片段，同時以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP40載體，回收較短片段，連接后得到重組載體pUC57-ELP80。將上述載體轉化后挑取單菌落提取質粒進行PCR驗證插入片段大小是否正確，并以pUC57-F/pUC57-R引物（表1）測序確認核苷酸序列的正確性。

圖1 遞歸定向連接得到多重復序列Fig.1 Cloning of ELP of different lengths by RDL

以SfiI和NotI雙酶切pET30a-G8（R），回收較長載體片段，以SfiI和NotI雙酶切pUC57-ELP20、pUC57-ELP40、pUC57-ELP60、pUC57-ELP80重組載體，回收較短目的片段，連接后得到重組表達載體pET30a-G8-ELP20、pET30a-G8-ELP40、pET30a-G8-ELP60、pET30a-G8-ELP80，轉化后挑取單菌落提取質粒進行XbaI和NotI雙酶切驗證插入片段大小是否正確，并以T7-F/T7 Ter-R引物（表1）測序確認核苷酸序列的正確性。

1.3.2 重組蛋白G8-ELP20、G8-ELP40、G8-ELP60、G8-ELP80的表達

將攜帶重組載體的大腸桿菌BL21（DE3）菌株接種于含50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB（Luria-Bertani）培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養12 h后，以1%接種量轉接至含50 μg/mL卡那霉素的800 mL LB培養基中，于兩只2 L搖瓶中37 ℃、220 r/min擴大培養至OD600nm為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30 ℃過夜誘導表達，菌液離心后收集菌體沉淀，用80 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）重懸，分裝后于超聲破碎儀中破碎，破碎條件設置為超聲4 s，間歇6 s，總破碎時間8 min，功率200 W。6 500 r/min離心15 min收集破碎沉淀，80 mL洗滌緩沖液洗滌兩次后，以16 mL含8 mol/L尿素的變性緩沖液4 ℃過夜溶解，變性溶解液6 500 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液等體積分成4 份，分別采取不同的復性方式進行復性。

1.3.3 融合蛋白包涵體的不同復性方式

稀釋復性：取4 mL融合蛋白變性溶解液，每隔2 h加入等體積的復性緩沖液，倍比稀釋直至尿素終濃度為2 mol/L，將稀釋復性后得到的16 mL蛋白溶解液過鎳柱純化，以含2 mol/L尿素的20、50、80 mmol/L咪唑溶液洗雜，含2 mol/L尿素的100 mmol/L咪唑溶液洗脫，將得到的蛋白洗脫液置于透析袋中，于含2 mol/L尿素的PBS中透析12 h，Bradford法測定蛋白濃度。

透析復性：取4 mL融合蛋白變性溶解液過鎳柱純化，以含8 mol/L尿素的20、50、80 mmol/L咪唑溶液洗雜，含8 mol/L尿素的100 mmol/L咪唑溶液洗脫，將得到的蛋白洗脫液置于透析袋中，每隔12 h換一次透析液，直至將蛋白溶解液替換為含2 mol/L尿素的PBS，Bradford法測定蛋白濃度。

柱上復性：取4 mL融合蛋白變性溶解液過鎳柱，以含6、4、2 mol/L尿素的復性緩沖液依次緩慢沖洗5～10 個柱體積，最后以含2 mol/L尿素的20、50、80 mmol/L咪唑溶液洗雜，含2 mol/L尿素的100 mmol/L咪唑溶液洗脫，將得到的蛋白洗脫液置于透析袋中，于含2 mol/L尿素的PBS中透析12 h，Bradford法測定蛋白濃度。

ITC純化：取4 mL融合蛋白變性溶解液，每隔2 h加入等體積的復性緩沖液，倍比稀釋直至尿素終濃度為2 mol/L，向稀釋復性后得到的16 mL蛋白溶解液中加入終濃度為2 mol/L的NaCl，37 ℃孵育30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀以含2 mol/L尿素的PBS重懸，Bradford法測定蛋白濃度。

復性后的蛋白得率由下式計算得出：

1.3.4 間接競爭ELISA測定重組蛋白結合活性

棋盤滴定確定間接競爭ELISA的最佳包被抗原抗體濃度。4 ℃過夜包被最佳濃度的人工抗原AFB1-牛血清蛋白，含吐溫的PBS（PBST）洗板3 次；4%脫脂乳37 ℃封閉2 h，PBST洗板3 次；以終質量濃度100 ng/mL為AFB1標準品最大競爭濃度，倍比稀釋16 個梯度，每個梯度設置3 個平行，與人工抗原競爭孔中加入的不同長度、不同復性方式獲得的納米抗體融合蛋白，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3 次；加入HRP標記抗His標簽的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3 次；顯色終止后測定孔中OD450nm，計算每種蛋白的IC50。

1.3.5 融合蛋白相變溫度測定

取以稀釋復性方式純化得到的4 種長度融合蛋白儲液，將其濃度均一為15 μmol/L，各加入濃度為5 mol/L的氯化鈉200 μL，使氯化鈉的終濃度為1 mol/L，每種蛋白取200 μL于酶標孔中，并設置3 個平行，在溫度由16 ℃升至52 ℃的過程中，每升溫2 ℃記錄一次OD350nm，以溫度為橫坐標、相對濁度為縱坐標作圖，斜率最大處即為該融合蛋白的相變溫度。

1.3.6 融合蛋白二級結構測定

取以稀釋復性方式純化得到的4 種融合蛋白儲液，將其質量濃度均一為0.3 mg/mL，取800 μL置于圓二色譜儀樣品檢測瓶中，設定二級結構測定程序，同時檢測空白背景值，將減去空白背景值后的數據導入在線擬合網站Dichroweb進行擬合[21]，得到4 種融合蛋白的峰圖與二級結構計算表。

1.4 數據處理

重組蛋白靈敏度數據使用Origin 2021軟件進行處理；蛋白質二級結構數據由在線網站Dichroweb獲得；電泳圖使用Quantity one進行分析。

2 結果與分析

2.1 表達載體構建

表達載體構建過程中重復序列的延長是以遞歸定向連接方式實現。如圖2A所示，分別得到了ELP20、ELP40、ELP60、ELP80序列。以SfiI和NotI分別雙酶切不同長度的ELP序列，克隆到SfiI和NotI雙酶切過的pET30a載體上，如圖2B所示，分別得到了不同長度的重組表達載體。

圖2 不同長度ELP片段及表達載體雙酶切驗證Fig.2 Verification of ELP of different lengths and expression vectors by double enzyme digestion

2.2 蛋白表達與復性結果

4 種融合蛋白的理論分子質量大小分別為26.53、34.87、43.22、51.56 kDa。SDS-PAGE結果顯示，誘導后的融合蛋白大小與預期一致（圖3）。4 種融合蛋白誘導表達破碎上清液中目標蛋白含量極少，絕大部分以包涵體形式存在于超聲破碎沉淀中（圖4）。將4 種融合蛋白的包涵體分別用4 種復性方法進行了復性，SDS-PAGE及Quantity one軟件分析結果顯示，4 種融合蛋白包涵體變性溶解液中目的蛋白含量均在50%以上（圖5，泳道1），4 種復性方式所得的融合蛋白純度差異不顯著（圖5，泳道2～5）；結合上樣濃度與收獲體積計算蛋白得率，4 種復性方式中，ITC純化得率最高（表2）。

圖3 融合蛋白結構示意圖與誘導前后SDS-PAGE分析Fig.3 Structural diagrams of and SDS-PAGE patterns of fusion proteins before and aft.er induction

圖4 破碎上清液與破碎沉淀Fig.4 SDS-PAGE patterns of proteins in supernatant and precipitate from disrupted cells

圖5 4 種復性方式得到4 種不同長度的蛋白Fig.5 SDS-PAGE patterns of four of proteins of different lengths obtained by four refolding methods

表2 不同復性方式所得重組蛋白得率Table 2 Yield of recombinant proteins obtained by different refolding methods

2.3 納米抗體靈敏度測定

間接競爭ELISA測定不同復性方式得到不同長度融合蛋白的IC50。圖6結果顯示，4 種復性方式中，稀釋復性的IC50為4 種復性方式中最低，4 種蛋白IC50分別為6.24、5.99、5.88、4.35 ng/mL，提示稀釋復性的方法更有利于重組蛋白重新折疊；4 種融合蛋白中，G8-ELP80的IC50最低，表明G8-ELP80靈敏度最高。

圖6 4 種蛋白的靈敏度測定Fig.6 Sensitivity of four proteins

2.4 融合蛋白相變溫度測定

當溶液中半數蛋白發生聚集時的溫度為該ELP標記蛋白的相變溫度，在以溫度為橫坐標、相對濁度為縱坐標的圖中表現為斜率變化最劇烈處所對應的橫坐標溫度值。融合蛋白的相變溫度與多種因素有關，如蛋白濃度、鹽離子種類、鹽離子濃度等[22]。將4 種融合蛋白稀釋至終濃度為15 μmol/L，在NaCl濃度為1 mol/L時，G8-ELP20、G8-ELP40、G8-ELP60、G8-ELP80的相變溫度分別為45、38、32、28 ℃（圖7），符合ELP重復數越多相變溫度越低的相變規律，與預估結果一致。

圖7 融合蛋白相變溫度Fig.7 Phase transition temperatures of fusion proteins

2.5 圓二色譜結果分析

納米抗體的結構是由9 個反向平行的β-折疊片層（A-B-C-D-E-F-G-H-I）組成，它們之間通過二硫鍵和鏈間氫鍵連接在一起[23]；ELP中含有大量重復序列VPGXG，當環境溫度低于相變溫度時，重復序列中的Pro-Gly是β-轉角結構[24]。結果顯示，4 種長度融合蛋白二級結構中，α-螺旋所占比例極低，β-結構是融合蛋白主要二級結構，與理論預估結果一致（表3）；隨著重復序列數的升高，α-螺旋、β-折疊、β-轉角比例均有所升高，無規卷曲結構比例則有所降低，且序列數越多此規律越不顯著；值得注意的是，G8-ELP80中α-螺旋的比例較G8-ELP20相對升高了75%，提示一定范圍內α-螺旋結構的升高可能與納米抗體的靈敏度相關。

表3 不同長度融合蛋白二級結構含量Table 3 Secondary structure contents of fusion proteins of different lengths%

3 討 論

當重組蛋白在大腸桿菌細胞中高度表達時，會形成高密度、不溶性的蛋白聚集體，由于錯誤折疊而不具備生物活性。包涵體中，重組蛋白的含量約為50%，其他成分為雜蛋白、脂多糖、質粒DNA等[25]。當重組蛋白在細胞中以包涵體形式表達時，雖然純化步驟較可溶性表達繁瑣，但也存在一定優點，大腸桿菌內部的蛋白酶未必能降解結構致密的包涵體，可實現重組蛋白的高表達，獲得質量可觀的重組蛋白[26]；包涵體中的重組蛋白純度較高，便于純化分離；對于一些在天然構象下對細胞存在毒害作用的蛋白質，包涵體表達是一種可行的方法[27]。包涵體變性溶解后的復性方法主要有稀釋復性、透析復性、超濾復性、柱上復性等。

以ELP作為純化標簽為目的蛋白的純化提供了一種非色譜分離的方法。相較于傳統的離子交換層析、疏水層析、親和層析，ELP標簽賦予融合蛋白相變特征，通過簡單的ITC即可實現目的蛋白的分離純化，具有經濟、操作方便、損耗低等優點[28]。以往研究表明，在大腸桿菌中外源蛋白與ELP標簽融合蛋白表達時多數為可溶性表達，利用ELP標簽的ITC，已成功純化出綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、硫氧還蛋白、氯霉素乙酰轉移酶等[29]重組蛋白，但由于ELP標簽相變性質受濃度影響較大，當融合蛋白的表達濃度低于1 μmol/L時，目的蛋白的分離純化效率極低[30]。

本研究中，18 ℃低溫過夜誘導后可溶性表達量依然較低，無法使用ITC進行純化，使用鎳柱雖然可以純化到有活性的目的蛋白，但是濃度卻極低，不能滿足后續捕獲AFB1后整體相變的要求。將存在于菌體沉淀中的重組蛋白包涵體變性溶解后，嘗試了不同的復性方式對其進行復性，實驗過程中，透析或超濾將尿素濃度降至2 mol/L以下時，出現蛋白溶液渾濁的現象，提示蛋白發生聚集，在PBS（pH 7.0）中不能穩定存在。已有研究報道，納米抗體在嚴酷的條件下具有很強的耐受性，并能抵抗化學和熱變性[31]，故而將其溶解在含2 mol/L尿素的PBS中測定其蛋白特性并計算復性比例。4 種復性方式中，稀釋復性得到的重組蛋白靈敏度最高；4 種重組蛋白中，G8-ELP80的靈敏度最高，IC50僅為4.35 ng/mL；相變溫度最低，在體系中氯化鈉濃度為1 mol/L、重組蛋白濃度為15 μmol/L時其相變溫度僅為28 ℃，表明在37 ℃條件下即可以先后進行AFB1的捕獲和聚集，避免了因溫度變化而導致回收率降低。

4 結 論

本研究成功獲得了4 種具有溫度刺激響應性和抗原識別特異性的納米抗體，并對4 種納米抗體的結合活性、復性方法、相變溫度、蛋白質二級結構等性質進行了系統研究，為易形成包涵體的融合蛋白復性時變性處理劑的去除程度提供新思路。后續將以此為基礎，建立以納米抗體為核心的全生物合成純化介質，用于AFB1樣品前處理，研究結果可為納米抗體的進一步功能化鞏固基礎。同時，已有借助ELP標簽的單克隆抗體相分離免疫檢測[32-33]，ELP標簽功能化的納米抗體或可依靠其在均相檢測體系中的優勢在快速檢測領域取得突破，如改進熒光共振能量轉移、開發生物傳感器等。