基于Illumina MiSeq測序技術探究冷藏菊黃東方鲀菌群演替規律

曾 鷺，劉淑集，陳曉婷，林河通,*，劉智禹,*

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建水產研究所 國家海水魚類加工技術研發中心，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013）

菊黃東方鲀（Takifugu flavidus）屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬。其肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，蛋白質含量高，同時富含多種必需氨基酸和鉀、磷、鈣等多種礦物質[1-2]。菊黃東方鲀養殖區域主要分布在福建、山東、江蘇、廣東等沿海地區，且養殖的菊黃東方鲀需在經備案的加工廠處理后，以鮮品（0～4 ℃冷藏）或凍品（-18 ℃貯藏）的形式進入市場流通[3]。然而，由于菊黃東方鲀體內蛋白質和水分含量較高，容易受到外源微生物的侵染，少部分微生物在魚體內不斷繁殖，迅速生長成為魚體的特定腐敗菌[4-5]，這些腐敗菌往往具有很強的致腐性[6]，會導致魚肉組織結構分解，氧化酸敗的速度加快，進而產生硫化物、醛、胺、有機酸等有害物質，嚴重影響魚肉的品質和貯藏期[7-8]。鑒定并抑制引起菊黃東方鲀冷藏期間腐敗變質的微生物菌群，是保持魚肉品質和延長貨架期的關鍵。

傳統分離培養技術鑒定菌種，需要多次純化培養，分離得到單菌株后，再由進一步的生理生化實驗鑒定得出結果。但是在培養過程中，只采用一種培養基進行培養時，不能或很難同時培養出所有的微生物，有些微生物需要在選擇性培養基才能培養，所以如果想要較準確地培育出大部分微生物，需要采用多種不同的培養基同時進行培養，增加了許多工作量。高通量測序技術作為一種免培養的分子生物學技術，通過提取樣品中微生物的DNA或RNA進行生物信息學分析，從而得到具體的群落多樣性信息[9-10]。它具有數據產出快速、通量高且分析全面等特點，能詳細反映樣本中微生物的菌落情況[11]。其中16S rDNA擴增子測序是指通過對V4區或V3～V4區序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增再測序的方法，常被應用于研究樣品中微生物群落組成結構，目前已被廣泛應用于土壤、根際、環境、動物腸道以及食品等領域的研究中[12-15]，極大改變了人們對微生物生態學的認識。高通量測序技術在河鲀中的應用主要在于探究河鲀腸道微生物的菌群結構分布[16-19]，而針對冷藏過程中河鲀微生物菌群組成和特定腐敗菌的研究，僅李萌等[20]研究表明了導致冷藏紅鰭東方鲀腐敗變質的關鍵菌主要是熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescent）、莓實假單胞菌（P.fragi）、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）和鄉間布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）。然而，不同品種、不同貯藏環境都會使腐敗菌的種類發生改變[21-24]，有關菊黃東方鲀在冷藏條件下表面微生物變化的研究還鮮見相關報道。

因此，本研究以菊黃東方鲀冷藏過程的菌落總數（total viable count，TVC）和揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值測定結果為依據，確定貯藏終點，通過高通量測序技術分析養殖菊花東方鲀魚肉在冷藏前期（0～3 d）、中期（3～6 d）、后期（6～15 d）的菌相演替變化規律，最終確定菊黃東方鲀冷藏期間的優勢腐敗菌及其致腐能力，以期為后期靶向抑制及品質控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養殖菊黃東方鲀購于福建省漳州市漳浦縣，養殖周期為2 a，體質量約（309.41±72.72）g，體長約（22.52±1.14）cm。參照DB/T 2042—2021《養殖菊黃東方鲀加工技術規范》進行宰殺，去內臟、魚皮、魚頭和魚鰭，隨后用冰水沖洗直至無污物無血水，瀝干，于（0±2）℃冰箱保藏。

甘油、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、無水碳酸鉀、硼酸、水溶性膠、0.01 mol/L鹽酸標準滴定溶液、甲基紅、溴甲酚綠 國藥集團化學試劑有限公司；LB營養瓊脂、0.85%無菌生理鹽水管 青島海博生物技術有限公司；生理鹽水 廣東環凱微生物科技有限公司；TVC測試片 廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Hieff?Robust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads 上海Yeasen公司；pMD18-T Vector連接試劑盒 日本TaKaRa公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機 德國Thermo Fisher公司；GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統 上海復日科技有限公司；Q32866Qubit?3.0熒光計 美國Invitrogen公司；ETC 811 PCR儀 北京東勝創新生物科技有限公司；3730XL測序儀 美國Applied Biosystems公司；DHP-9162恒溫培養箱 太倉市科教器材廠；TH2-C恒溫搖床 太倉市實驗設備廠；HC-2518R冷凍高速離心機英國BBI公司。

1.3 方法

1.3.1 TVC測定

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。取1、3、5、7、9、11 d的魚肉樣品25 g，絞碎后加入225 g生理鹽水，振蕩混勻，靜置3 min，取上清液，并進行梯度稀釋，制成不同濃度的菌懸液。分別吸取1 mL菌懸液于TVC測試片中，30 ℃培養48 h。

1.3.2 TVB-N值的測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中第三法微量擴散法進行測定。取1、3、5、7、9、11 d的魚肉樣品20 g，浸泡0.5 h后，取上清液進行測定。

1.3.3 16S rDNA高通量測序

1.3.3.1 實驗材料及預處理

取冷藏解凍后菊黃東方鲀的背部肌肉分別于0、3、6、9、12、15 d進行采樣，并依次編號為R0、R3、R6、R9、R12、R15，后測序。

1.3.3.2 細菌總DNA的提取

參考李凱凱等[25]的方法，將絞碎后的樣品加入適量鋼珠和裂解液，放入2 mL離心管中，使用破碎儀破碎后用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒進行提取。

1.3.3.3 PCR擴增

引物序列：341F-CCTACGGGNGGCWGCAG；805R-GACTACHVGGGTATCTAATCC。第1輪擴增：反應體系（30 μL）為2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR products 10～20 ng、H2O 9～12 μL；第2輪擴增：反應體系（30 μL）：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、Primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR products 20～30 ng、H2O 9～12 μL。

1.3.4 優勢腐敗菌的分離鑒定

參考孟凌云等[26]的方法并稍作修改，將冷藏后期的樣品攪碎，加入無菌水稀釋到一定梯度，隨后用接種環劃線到固體培養基中，30 ℃培養36 h，挑取不同形態的單菌落（共10 株）于LB液體培養基中擴大培養，劃線純化3 次后，菌液中加入20%的甘油進行保種，置于-20 ℃中保藏。菌種進行測序、鑒定。

1.3.5 優勢腐敗菌致腐能力的比較

參考趙宏強等[27]的方法對不同腐敗菌致腐能力進行分析，并根據1.3.1、1.3.2節方法分別檢測冷藏初期與末期時單位數量腐敗菌產生的TVC和TVB-N值，以腐敗代謝產物產量因子作為評估腐敗能力的指標，按下式計算：

式中：TN1、TN0分別為末期和初期TVB-N值/（mg/100 g）；TC1、TC0分別為末期和初期TVC/（CFU/g）。

1.4 數據處理

利用mothur進行rarefaction分析，應用R軟件制作曲線圖。采用Excel 2007進行數據統計及處理，SPSS Statistics 21進行顯著性分析，Origin 8.5繪制曲線。采用MEGA 11.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菊黃東方鲀冷藏期間TVC和TVB-N值變化情況

TVC和TVB-N與水產品鮮度密切相關，常用來反映水產品的腐敗情況。有研究表明，可食用生魚肉的TVC上限值為5.00（lg（CFU/g））[28]，Zhou Ran等[29]在4 ℃冷藏條件下測得貯藏4 d的暗紋東方鲀TVC為5.07（lg（CFU/g）），而經過保鮮處理的河鲀魚肉則是到6 d TVC才超過5.00（lg（CFU/g）），河鲀的貨架期延長了2 d。如圖1所示，在貯藏過程中冷藏菊黃東方鲀的TVC逐漸增加，5 d達到了4.93（lg（CFU/g）），接近生魚肉可食用上限值，而在11 d TVC升至7.32（lg（CFU/g）），超過食品中微生物的最高限值7.00（lg（CFU/g））[30]，因此可以說明菊黃東方鲀在冷藏情況下能貯藏5 d，冷藏到11 d已經腐敗。

圖1 菊黃東方鲀冷藏過程中TVC的變化Fig.1 Changes in total viable count of T. flavidus during cold storage

根據GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》規定，海水魚TVB-N值一級鮮度界限值＜15.00 mg/100 g[31]，但是對于不同品種的魚，其TVB-N值的可接受上限值不同，如鱈魚魚肉中TVB-N值的可接受上限為60 mg/100 g，銀鯉和黑鱸則分別為35.00 mg/100 g和10.00 mg/100 g[32-34]，而根據馬妍等[35]的研究結果，河鲀TVB-N值的上限為12～13 mg/100 g。如圖2所示，隨著冷藏時間的延長，微生物數量不斷增加，促進了蛋白質降解，使得菊黃東方鲀的TVB-N值從7 d以后迅速增加，到9 d TVB-N值增加到12.16 mg/100 g，達到上限值；到11 d TVB-N值已超過可接受上限值。

圖2 菊黃東方鲀冷藏過程中TVB-N值的變化Fig.2 Changes in total volatile basic nitrogen content of T. flavidus during cold storage

TVC、TVB-N值、感官評價常作為預測貨架期的指標，但是感官評價過于主觀，而TVB-N值的變化是由于微生物的繁殖，一般常用TVC預測貨架期。如周慧等[36]測定虹鱒魚在0 ℃貯藏條件下，6 d TVC為5.59（lg（CFU/g）），超過生魚肉可食用上限值，而15 d的TVB-N值為18.34 mg/100 g，未達到腐敗標準（20.00 mg/100 g），所以采用TVC確定虹鱒魚0 ℃貯藏條件下的貨架期終點為5 d。根據測定結果，菊黃東方鲀5 d的TVC接近可食用上限，TVB-N值符合一級鮮度界標準，因此確定菊黃東方鲀在0 ℃冷藏條件下的貨架期終點為5 d。

2.2 16S rDNA高通量測序結果

2.2.1 有效序列長度

通過細菌V3～V4區的測序，對各樣本數據進行質控過濾，得到有效數據。從河鲀魚肉共檢出70.80多萬條有效序列，平均長度在380～398 堿基對，在相似度97%的水平上進行歸類操作，發現樣品在種屬水平上分類，共聚成2 026 個可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。

稀釋曲線常被用來評估樣品測序數據量是否合理，以從樣本中隨機抽取的序列數為橫坐標，與之對應的OTU數為縱坐標，并繪制曲線，曲線的變化趨勢可以間接反映物種豐度。Shannon曲線反映了樣品中微生物的多樣性，橫坐標為測序過程讀取的樣本數，隨著樣本數的增加，曲線的趨勢逐漸平坦時，說明此時的測序數據量可以充分反映樣品中絕大多數的微生物信息[37]。如圖3、4所示，當測序量低于10 000時，稀釋曲線呈現顯著上升趨勢，當測序數量逐漸增加達到40 000時，曲線已趨于平緩，且Shannon曲線已經完全達到飽和狀態，說明細菌多樣性已經得到充分展示，不會再發生變化，本研究測序量滿足后續生物信息學分析要求。

圖3 不同冷藏時間菊黃東方鲀樣品稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of bacterial community in refrigerated T. flavidus at different storage times

圖4 不同冷藏時間菊黃東方鲀樣品Shannon曲線Fig.4 Shannon curves of bacterial community in refrigerated T. flavidus at different storage times

2.2.2 多樣性分析

α多樣性指數主要包括Chao1、Shannon和Simpson指數，前一個指數可以反映微生物群落分布的相對豐度，后兩者則反映了群落分布的多樣性。覆蓋率用來檢驗本次測序結果能否代表樣本的真實情況[38]。經檢測，樣品覆蓋率都達到了99%以上，表示大部分序列都已被檢出，說明本研究能夠用于樣品微生物多樣性分析。

如表1所示，河鲀魚肉的Chao1指數在第3天達到最大值，隨后逐漸減小，說明河鲀冷藏3 d細菌群落的OTU數目最多，菌群豐度最大；Simpson指數越小，菌群多樣性越高，魚肉在第3天的Simpson指數為0.20，此時菌群多樣性最高，隨后降低，這與和Huang Wenbo等[39]研究結果相似，說明隨著冷藏時間的延長，環境中氧含量逐漸降低，蛋白質等大分子被分解，為優勢物種的快速生長提供條件，同時抑制了部分微生物的生長，導致后期多樣性和豐富度下降。

表1 樣本α多樣性指數統計Table 1 Statistics of α diversity indexes of samples

2.2.3 菌群結構分析

菌群變化柱狀圖可以直觀展示樣本隨著冷藏時間的延長，微生物物種組成及比例的變化情況。通過對比數據庫，對OTU進行物種分類，并分別在門、綱、目、科、屬水平作優勢物種相對豐度柱狀圖（豐度占比小于1%的物種歸類為others）。

2.2.3.1 菌群門、綱水平分布

養殖菊黃東方鲀在0 ℃冷藏過程中魚肉的菌群變化豐富，在門水平上檢測到占比較大的菌門，分別有變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）等，在綱水平上檢測到了變形菌綱（Gammaproteobacteria）、葉 綠 體 綱（ C h l o r o p l a s t ） 、α- 變 形 桿 菌 綱（Alphaproteobacteria）和梭菌綱（Clostridia）等。從圖5a可以看出，在冷藏前期，藍細菌門在魚肉微生物菌群中的占比最大，達到56.60%，其次為未分類的細菌，所占比例為9.31%。隨著冷藏時間的延長，藍細菌門比例顯著降低，由46.51%減少至1.22%，而變形菌門的比例則顯著增長，從15.90%增長至96.50%（15 d），冷藏期間最高占比為99.28%，成為菊黃東方鲀冷藏期間的優勢菌門。

圖5 樣本微生物在門水平（a）和綱水平（b）上相對豐度分布Fig.5 Relative abundance of bacteria in samples at the phylum (a) and class level (b)

整個貯藏過程綱水平的相對豐度分布情況與門水平相似，但是在綱水平中出現了更多的細分，變形菌門主要分為α-變形菌綱、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），厚壁菌門主要細分為梭菌綱和芽孢桿菌綱（Bacilli），擬桿菌門包括黃桿菌綱（Flavobacteriia）和鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）（圖5b）。

2.2.3.2 菌群屬水平分布

菊黃東方鲀冷藏過程中，在屬水平上的微生物菌群變化共有10 個主要的菌屬，分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptophyta）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、苯基桿菌屬（P h e n y l o b a c t e r i u m）、鞘氨醇菌屬（Chitinophaga）、食酸菌屬（Acidovorax）（圖6）。

圖6 樣本微生物在屬水平上相對豐度分布Fig.6 Relative abundance of bacteria in samples at the genus level

隨著冷藏時間的延長，魚肉中主要菌屬由9 種增加至12 種，隨后逐漸遞減為假單胞菌屬、希瓦氏菌屬，作為水產品中常見的優勢腐敗菌，經常在腐敗過程中發揮著重要作用[40]。在0 d，優勢腐敗菌屬（相對豐度＞1%）有假單胞菌屬、鏈霉菌屬、希瓦氏菌屬、梭菌屬、鞘氨醇單胞菌和黃桿菌屬等，3 d增加了不動桿菌屬、苯基桿鞘氨醇菌屬和食酸菌屬；6 d僅存在假單胞菌屬、鏈霉菌屬、希瓦氏菌屬和梭菌屬；9～15 d假單胞菌屬和希瓦氏菌屬占比分別超過86.40%和12.24%，成為最優菌屬。

假單胞菌屬和希瓦氏菌屬都屬于革蘭氏陰性菌，具有很強的蛋白分解能力且能生存在低溫環境下，經常在有氧冷藏的水產品貯藏末期中被檢出[41-42]。假單胞菌屬的腐敗機制主要是使水產品產生小分子醛酮及產生異味的揮發性代謝物。希瓦氏菌屬則是可以產生大量硫化物，并且黏附在水產品表面形成生物被膜，分解蛋白，進一步引起腐敗變質[43-47]。目前，已經檢測到石斑魚、大黃魚、三文魚等在冷藏過程中產生的優勢腐敗菌多為假單胞菌屬或希瓦氏菌屬[48-50]。

總體而言，在冷藏期間變化較大的菌屬主要有假單胞菌屬、鏈霉菌屬、希瓦氏菌屬，其中鏈霉菌屬僅在前6 d占比較大，而9 d后比例迅速下降直至消失；希瓦氏菌屬在6 d開始迅速增長，在第9天達到最大比例，隨后逐漸減少；假單胞菌屬冷藏初期的比例較低，在后期占據比例超過86.40%，成為優勢腐敗菌。綜上表明，菊黃東方鲀在0 ℃冷藏過程中存在著復雜的菌群變化，且隨著冷藏時間的延長，腐敗微生物種類更趨于集中單一化，在冷藏末期分離純化得到的優勢腐敗菌為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬。

2.3 優勢腐敗菌的分離、鑒定

從冷藏菊黃東方鲀末期共篩選出10 株菌，分別命名為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10，其菌落形態大多表現為光滑、邊緣整齊、隆起、易挑起，但是菌落大小不一，顏色有白色和淡黃色的區別。以1.70%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落純度，如圖7所示，各菌株均出現了單一條帶，顯示PCR擴增較成功，可以用于后期測序。

圖7 高通量測序法下V3～V4可變區DNA電泳圖Fig.7 Electropherogram of PCR-amplified V3–V4 variable region

所得序列進行BLAST分析，選取同源性超過99%的菌株序列構建系統進化樹。圖8所示即為最高相似度菌種名稱及其登錄號，10 株菌株分別是波羅的海希瓦氏菌（S.baltica）、哈夫尼希瓦氏菌（S.hafniensis）、希瓦氏菌屬（S h e w a n e l l as p.）、液化沙雷氏菌（S.liquefaciens）、維氏氣單胞菌（A.veronii）、P.extremorientalis、產氮假單胞菌（P.azotoformans）、熒光假單胞菌（P.f l u o re s c e n s）、杰氏假單胞菌（P.jessenii）、隆德假單胞菌（P.lundensis）。其中希瓦氏菌和假單胞菌的比例比較高，符合菌相變化規律。

圖8 基于16S rDNA序列的同源性菌株系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA sequences

2.4 優勢腐敗菌的致腐能力

不同腐敗菌的致腐能力不同，通過產量因子可以定量表示各種腐敗菌的致腐能力大小，產量因子數值越大，則腐敗能力越強。如表2所示，熒光假單胞菌和產氮假單胞菌的產量因子分別為1.05×10-9、3.05×10-10mg/CFU，明顯高于希瓦氏菌屬，致腐能力更強。菊黃東方鲀冷藏期間產生的腐敗菌的致腐能力由高到低依次為熒光假單胞菌、產氮假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、波羅的海希瓦氏菌。該實驗結果與倪榮[51]和于淑池[52]等的研究結果相似。

表2 不同腐敗菌腐敗能力的分析Table 2 Spoilage capacity of different spoilage bacteria isolated from T. flavidus

3 結 論

根據0 ℃冷藏過程中菊黃東方鲀魚肉的TVC和TVB-N值測定結果，得出其冷藏終點為5 d。利用高通量測序技術對菊黃東方鲀冷藏期間魚肉的菌相變化進行研究，發現魚肉在冷藏初期菌群多樣性指數高，而冷藏末期菌屬較為單一，假單胞菌屬和希瓦氏菌屬占比較大，故將其判定為菊黃東方鲀冷藏期間的優勢腐敗菌，其中假單胞菌屬比例遠高于希瓦氏菌屬，是導致魚體腐敗的主要腐敗菌。

通過傳統培養基法對菊黃東方鲀冷藏末期的腐敗菌進行分離純化，共篩選出10 株菌株，經16S rDNA測序技術鑒定為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，符合菌相變化規律，進而驗證高通量測序結果的準確性，并對常見幾種菌進行致腐能力分析，發現熒光假單胞菌的致腐能力最強，產氮假單胞菌次之，最弱的哈夫尼希瓦氏菌和波羅的海希瓦氏菌，二者致腐能力相當。本研究旨在為靶向抑菌、延長菊黃東方鲀的貨架期提供理論依據。