雙官能團化介孔二氧化硅材料的合成及其在氨基糖苷類藥物檢測中的應用

唐敏敏，邵雪梅，高 巍，宋錦柱，朱曉軍，馮 云，鄒 潔,*，許丹科*

（1.江蘇省產品質量監督檢驗研究院，江蘇 南京 210000；2.南京大學化學化工學院，生命分析化學國家重點實驗室，江蘇 南京 210046；3.南京醫科大學公共衛生學院，江蘇 南京 211166）

氨基糖苷類藥物（aminoglycosides，AGs）是一類廣譜抗生素，自1943年首次發現以來，在治療重大細菌感染和結核病方面發揮著重要作用[1]。但是毒理學研究表明，AGs表現出相當嚴重的副作用，例如耳毒性和腎毒性，過敏反應。牛奶是日常飲食中的常見食物，含有脂肪、多肽、蛋白質和礦物質元素等多種營養物質。AGs具有廣譜抗菌性，可治療奶牛乳腺炎、奶牛結核病等，還可作為促生長劑提高飼料報酬率，因此被直接或間接使用于奶和奶制品的生產、加工和貯藏中[2]。人類食用這些有藥物殘留的動物產品也會遭受風險，此外，還易導致細菌耐藥性的發展，從而給疾病治療增加難度。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》中規定了AGs在不同動物組織中的最大殘留限量，規定在牛奶中慶大霉素不得超過200 μg/kg，卡那霉素不得超過150 μg/kg，新霉素不得超過1 500 μg/kg。為規范AGs使用，政府每年均需要投入大量的人力物力保證農產品安全。因此，建立具有高準確度和靈敏度的AGs的檢測方法尤為重要。

固相萃取（solid phase extract，SPE）在獸藥前處理中發揮相當重要的作用，不僅能夠富集目標物，還可以凈化樣品基質。牛奶中AGs中最常用的是C18反相SPE[3]或MCX、WCX離子交換模式的SPE[4-7]。與單模式吸附劑相比，混合模式吸附劑通過多種相互作用具有更好的吸附選擇性，可以通過控制洗滌條件輕松去除雜質。除了常規使用的SPE柱外，不少研究者利用分子印跡[8-9]或磁珠、石墨烯等材料鍵合硼酸基團[10]、羥基[11-12]、羧基[13]開發了一系列AGs的吸附劑。介孔材料MCM-41型材料的骨架由六邊形排列的圓柱形介孔組成，具有高表面積和窄孔徑分布，優異的孔隙結構，高的熱穩定性和化學穩定性，其表面具有大量的硅羥基，可通過官能團的修飾增加功能，在吸附化學領域引起了極大的研究興趣[14]。目前已有文獻報道表面修飾的介孔材料在鉛、陰離子有毒偶氮染料、生物毒素等方面的應用[15-18]，但在AGs富集上還應用較少。

由于AGs不具有揮發性，沒有發色團或者熒光團，不適合直接進行紫外或熒光檢測[1]，需要進行衍生處理，這增加了前處理的復雜性。隨著質譜技術的出現，液相色譜-串聯質譜技術成為最簡單和準確的檢測手段[2]。在色譜分離上，AGs是具有高極性的化合物，它們在普通反相色譜柱上的保留相當弱[13]。最常見的解決方法是在流動相中添加離子對試劑[10]。但是，這些添加劑可能會導致色譜柱嚴重污染和電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）的離子抑制作用[19]。Amide柱為酰胺基鍵合亞乙基橋雜化顆粒色譜柱，較C18反相柱、親水型的HSS T3和BEH HILIC正相柱，具有易保留與分離強極性分析物的特點，同時可避免離子對試劑對儀器的污染，因此比離子對色譜法更有優勢。

本研究基于介孔材料MCM-41開發了一種新的反相/陽離子交換混合模式的吸附劑，以安普霉素（apramycin，APC）、慶大霉素（gentamicin，GTC）、卡那霉素（kanamycin，KNM）、新霉素（neomycin，NMC）、阿米卡星（amikacin，AKH）和妥布霉素（tobramycin，TBC）6 種AGs為目標分析物。合成的雙官能團化的吸附劑中含有豐富的羧基，在合適的pH值下可解離，預期通過陽離子交換作用有效地提取AGs，同時，合成材料和AGs有一定的疏水相互作用，可通過調整淋洗液洗去雜質，進一步實現凈化。開發的吸附劑對目標物有較好的吸附能力和良好的選擇性，并進一步評估其在超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析中對基質效應（matrix effect，ME）的改善效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂牛奶樣品 江蘇南京蘇果超市。實驗前經過國家標準方法（GB/T 22969—2008《奶粉和牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》）測定不含6 種AGs中的任何一種，作為基質空白樣品用于ME和方法開發研究。

MCM-41 江蘇先豐納米材料科技有限公司；十八烷基三甲氧基硅烷（octadecyltrimethoxysilane，C18TMS） 上海泰坦科技股份有限公司；無水甲苯、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）南京化學試劑股份有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、琥珀酸苷（succinic acid glycoside，SAA）、三氯乙酸、磷酸氫二鉀 阿拉丁化學試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。AGs標準品 上海安譜實驗科技股份有限公司（生產商為德國Dr.EhrensorferGmbH公司）。

1.2 儀器與設備

Arium Pro超純水系統 德國Sartorius公司；ME104E萬分之一電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；5810R高速冷凍離心機 美國Eppendorf公司；DZF-6051真空干燥箱 南京市南北儀器公司；Nicolet Is50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；JEOL JSM-7800F熱場掃描電子顯微鏡、JEOL 2800高通量投射電子顯微鏡 日本電子公司；JWBK200B比表面積和孔徑分析儀 北京精微高博科技有限公司；API 6500 Plus三重四極桿串聯質譜儀（搭載Sciex Exion LC超高效液相色譜） 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 C18/COOH功能化介孔MCM-41材料的合成

1.3.1.1 C18/NH2功能化介孔MCM-41材料的制備

根據文獻[20]的方法進行合成，并作修改。具體如下，將1 g MCM-41分散于100 mL無水甲苯中，在60 ℃機械攪拌20 min，隨后逐滴加入APTES和C18TMS各1.2 mL，于110 ℃油浴中劇烈攪拌回流15 h，將所得的白色固體產物收集，并用無水乙醇洗滌3 次，于烘箱中真空干燥（真空度-0.08 MPa，65 ℃，12 h）得到C18/NH2功能化的介孔MCM-41材料（MCM-41@NH2@C18）。同時，對照材料分別為不加入APTES和C18TMS，僅加入APTES，其余處理方法相同。

1.3.1.2 C18/COOH功能化介孔MCM-41材料的制備

羧基功能化的方法參照文獻[21]，并作修改。稱取C18/NH2功能化介孔MCM-41材料0.8 g，分散于100 mL DMF中，室溫攪拌20 min。稱取11.5 g SAA溶于50 mL DMF中，逐滴緩慢滴入攪拌均勻的反應體系中，滴加完之后繼續室溫攪拌24 h。反應結束后，收集白色粉末，并用無水乙醇洗滌3 次，于烘箱中真空干燥（65 ℃、12 h）得到最終反應產物（MCM-41@COOH@C18）。制備流程示意圖見圖1。

圖1 MCM-41@COOH@C18的合成示意圖和檢測流程圖Fig.1 Schematic diagram for the synthesis of MCM-41@COOH@C18 and its application in SPE

1.3.2 樣品制備

準確吸取牛奶樣品1.0 mL，加入5%三氯乙酸溶液10 mL和0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL，于50 mL塑料離心管中混合。渦旋30 s，振蕩5 min。在4 ℃、10 000 r/min離心2 min后，將上清液轉移到另一50 mL離心管中，用10 mol/L NaOH溶液調節pH值至6.0，備用。

1.3.3 SPE步驟

將MCM-41@COOH@C18介孔微球（30 mg）裝填至兩端具有篩板的SPE小柱中（3 mL）。使用前預先用3 mL甲醇和3 mL水活化填料。將上述提取溶液全部通過SPE小柱后，依次用2 mL水和2 mL甲醇淋洗，抽干。用1 mL水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）洗脫，收集洗脫液，在UPLC-MS/MS分析之前使用0.22 μm濾膜過濾，SPE過程示意圖見圖1。

1.3.4 回收率實驗

日內回收率實驗：在空白牛奶樣品中分別加入5、50、200 ng/mL的AGs標準品，每個質量濃度做6 次重復。按照建立的方法進行實驗，計算回收率和精密度。

日間回收率：在空白牛奶樣品中分別加入5、50、200 ng/mL的AGs標準品，每個濃度做6 次重復，按照建立的方法測試3 d，計算回收率和精密度。

1.3.5 UPLC-MS/MS檢測

在Waters ACQUITY BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）上進行色譜分離，流動相A為2 mmol/L乙酸銨溶液（1%甲酸），流動相B為2 mmol/L乙酸銨乙腈溶液（1%甲酸）。線性梯度為：0～2.5 min，20% A、80% B；2.5～3.5 min，20%～65% A、80%～35% B；3.5 ～5.5 m i n，6 5%～9 0% A、3 5%～1 0% B；5.5～6.5 min，90% A、10% B；6.5～6.6 min，90%～20% A、10%～80% B；6.6～9 min，20% A、80% B。流動相流速為0.3 mL/min。柱溫設置為40 ℃，進樣量為2 μL。

通過使用注射泵以10.0 μL/min的流速連續注入AGs混合標準溶液（100.0 ng/mL），優化ESI＋的質譜參數。MS條件：ESI＋模式，離子源電壓5.5 kV；霧化溫度550 ℃；霧化氣（空氣）壓力50 psi；輔助氣（空氣）壓力55 psi；氣簾氣（氮氣）壓力45.0 psi。在多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式下進行采集。選擇質子化的分子離子作為母離子，使用兩個子離子進行定量和定性。MRM模式質譜參數如表1所示。

表1 MRM模式下AGs的質譜優化參數Table 1 Optimized MS parameters for AGs in MRM mode

1.3.6 標準溶液配制

標準儲備液配制：準確稱取適量標準品于10 mL聚丙烯容量瓶中，用水溶解后定容，配制成0.5 mg/mL的標準儲備溶液。

混合標準中間溶液配制：分別吸取5 mL標準儲備溶液置于50 mL聚丙烯容量瓶中，用水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）定容，配制成50 μg/mL的中間液。

混合標準工作溶液配制：溶液標準曲線用水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）將混合標準中間液稀釋至5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的一系列質量濃度。基質匹配標準溶液用基質空白溶液稀釋至相同質量濃度。

1.4 數據統計分析

使用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析處理，采用Microsoft Excel 2010進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 吸附材料的表征

由于MCM-41介孔材料具有均一孔徑的長程有序的孔道結構和極高的比表面積，非常適合作為吸附材料[14]。所制備的MCM-41@COOH@C18不破壞原有的孔道結構，在SEM（圖2a）中可以清楚地觀察到蠕蟲狀的顆粒，呈簇狀生長，與Zhang Jiaojing等[22]的報道一致，排列致密，最小粒徑約為200 nm。此外，如圖2b所示，TEM顯微圖片證明了高度有序的介孔結構，顯示了約4 nm寬的有序通道的存在。

圖2 MCM-41@COOH@C18的掃描電鏡圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig.2 SEM (a) and TEM (b) micrographs of MCM-41@COOH@C18

通過氮氣吸附脫附技術，MCM-41和MCM-41@COOH@C18兩種材料的吸附-脫附曲線和孔徑分布如圖3所示。根據IUPAC分類，這兩條曲線為IV型。這種等溫線是介孔材料的典型特征曲線[23]。MCM-41的BET比表面積為1 049.9 m2/g，平均孔徑為3.6 nm。從圖3a可以看出，相對壓力（P/P0）＜0.3時，氮的吸附量隨著P/P0增加而增加。這是因為在初始階段發生了單層吸附。P/P0為0.3～0.4時，由于氮氣在介孔材料中發生毛細管團聚，氮氣吸附量急劇上升。當P/P0為0.4～1時，氮吸附量增長緩慢，說明材料外比表面積較低，孔隙數量較少。引入—C18和—COOH基團時，樣品表現出不那么尖銳的臺階，并且MCM-41@COOH@C18的孔徑顯示出了雙峰孔分布，雙官能團修飾后材料的比表面積和孔徑都有一定程度的減小，比表面積為505.8 m2/g，平均孔徑為2.6 nm，這歸因于修飾的基團占據了結構通道。

圖3 N2吸附-脫附等溫線和孔徑分布曲線Fig.3 N2 adsorption-desorption isotherm and pore size distribution curves of MCM-41 and MCM-41@COOH@C18

為了驗證合成的吸附劑有效基團，圖4顯示了MCM-41原材料和合成后的MCM-41@COOH@C18的傅里葉變換紅外光譜。MCM-41和MCM-41@COOH@C18在808、978 cm-1和1 088 cm-1處顯示出二氧化硅的典型特征峰，分別對應Si—O—Si對稱鍵、Si—OH伸縮鍵、Si—O—Si不對稱鍵的振動。光譜中觀察到的3 445、3 550 cm-1和1 632 cm-1，1 651 cm-1處的吸附帶為硅烷醇基團的—OH拉伸[22]。由于C18和羧基基團的修飾，合成后的MCM-41@COOH@C18在2 855 cm-1和2 928 cm-1處出現兩個新峰，這是由于C18鏈上—CH2—和—CH3的C—H振動[18]。1 724 cm-1的新峰是羧基的C＝O峰，這些結果證實了MCM-41表面改性的成功。

圖4 MCM-41, MCM-41@COOH@C18的傅里葉紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectra of MCM-41 and MCM-41@COOH@C18

2.2 SPE條件的優化

以上結果證明成功合成了該介孔材料，制備好的MCM-41@COOH@C18材料具有良好的水分散性，可以在水溶液中均勻分散，沒有任何聚集。選擇的6 種AGs化學結構中均有許多氨基和羥基，屬于親水性的化合物。預測富集機理是反相和離子交換兩種模式共同決定的，由于MCM-41@COOH@C18含有豐富的羧基，羧基在合適的pH值條件下可解離，可通過陽離子交換有效地富集AGs，同時，鍵合的C18和AGs有一定的疏水相互作用，可以利用淋洗液的選擇進一步分離目標物和雜質。為評估MCM-41@COOH@C18介孔材料在富集AGs的適用性，進一步優化可能影響提取的參數，例如提取液種類、提取時的pH值（3.0～7.0）、吸附劑的量、洗脫溶劑種類、洗脫溶劑體積。

2.2.1 提取液種類選擇

常用的AGs提取溶劑有磷酸鹽緩沖溶液、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液。對這3 種溶液的提取效果分別進行比較，發現用磷酸鹽緩沖液和乙二胺四乙酸二鈉處理后的樣品提取液渾濁，影響后續SPE柱凈化和回收率實驗。三氯乙酸提取后，離心后的溶液較為澄清，沒有絮狀雜質。說明三氯乙酸易于沉淀牛奶中的蛋白質，同時加入的磷酸鹽緩沖液有助于pH值的調節，因此最終選擇5%三氯乙酸溶液10 mL和0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL作為提取溶液。

2.2.2 pH值的優化

所制備的MCM-41@COOH@C18具有大的比表面積、均勻的孔徑和良好的雙官能團修飾。經過SPE時，備用溶液的pH值會影響目標物的離子化。合成的雙功能化吸附劑中含有豐富的羧基，在適宜的pH值下可解離，與AGs上的氨基發生離子交換作用，因此比較了備用溶液的pH值為3、4、5、5.5、6、6.5、7時，目標物在SPE柱上的保留情況。富集前牛奶中的AGs質量濃度為100 ng/mL，保證同樣的SPE柱填充量為30 mg，將通過SPE柱的不同p H 值的樣品溶液收集，用G B/T 2 2 9 6 9—2 0 0 8 進行檢測（預先經過實驗驗證，該方法回收率范圍86.9%～98.5%），得到富集前后備用溶液中的AGs含量。圖5表明，當溶液pH值為3和4時，每種目標藥物在合成的吸附填料上的富集率均不超過50%，當pH值為5和5.5時，AKH、KNM的富集率不超過80%，當溶液pH值為6～7時，溶液中的AGs在SPE柱上的富集率較高。這說明樣品pH值是影響離子交換模式的關鍵因素，綜合考慮，選定樣品溶液的pH值為6，此時目標物的富集率為84.0%～97.6%。

圖5 樣品pH值對富集效率的影響Fig.5 Effect of pH on enrichment efficiency

2.2.3 SPE柱填料用量的選擇

因為吸附劑承載目標物的能力有限，為了獲得最大的富集效果，足夠的吸附劑用量必不可少，選擇SPE柱填充量為30 mg，比較不同質量濃度（40、80、400 ng/mL和2 000 ng/mL）的氨基糖苷溶液的回收率情況（圖6a），發現對于每一種AGs，不同質量濃度的相應目標物均能取得較為一致和穩定的回收率，且回收率范圍均在70%～110%之間，滿足分析方法要求，說明30 mg的填料含量不會存在柱過載現象，因此選擇SPE填料量為30 mg。

圖6 不同條件對回收率的影響（n=3）Fig.6 Effect of SPE conditions on recovery (n = 3)

2.2.4 淋洗液的選擇

淋洗液在一個完整的SPE過程中可洗滌富集在SPE填料上的共萃取物，有效將目標物和干擾組分分離。理想的淋洗液應不損失目標物同時又可洗滌雜質，減少基質干擾。選擇2 mL水和2 mL甲醇兩種不同性質的溶劑作為淋洗液，收集后經過UPLC-MS/MS檢測，均沒有目標物存在，說明淋洗液不會造成目標物的損失。

2.2.5 洗脫溶劑的選擇

AGs分子中具有豐富的氨基，可以與合成的MCM-41@COOH@C18中的羧基產生陽離子交換作用，在洗脫溶劑中加入酸會有助于削弱陽離子交換相互作用[24]。AGs又是極性較高的一類藥物，因此在洗脫溶劑的選擇上，選擇乙腈、水和甲酸的混合物為洗脫溶劑，其中，乙腈的比例不宜過高，過高的乙腈含量會導致目標藥物和吸附劑之間的親水相互作用不易被破壞。設定為在整個洗脫體系中乙腈體積分數為5%，酸溶液的選擇既能提供一定的酸度，也要適用于質譜離子源的離子化，因此選擇揮發性酸甲酸。選擇提取液的pH值為6，SPE填料量為30 mg，水和甲醇為淋洗液，比較甲酸體積分數從0%到5%以選擇最優的洗脫溶劑。從圖6b可以看出，當甲酸體積分數為2%時，6 種AGs回收率均超過70%。因此，選擇洗脫液比例為水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）。

2.2.6 洗脫液體積優化

除了洗脫溶劑的類型，洗脫溶劑的體積也影響著整個SPE的回收率。比較水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）1 mL和2 mL對目標物回收率的影響，其他參數保持相同。如圖6c所示，這兩種洗脫體積對目標物的回收率并沒有造成顯著性差異，1 mL的洗脫液用量回收率均超過70%，說明1 mL的洗脫用量足夠洗脫AGs。洗脫體積增加，造成目標物的稀釋，還需要采取后續的濃縮步驟，會增加實驗的復雜程度。因此選擇洗脫液用量為1 mL。

2.3 ME評估

在HPLC-MS/MS經常觀察到信號增強或抑制效應，導致回收率偏高或者偏低[25]。牛奶中含有一些內源性物質，如蛋白、脂質、氨基酸和其他復雜成分[10]，ME可通過基質匹配標準曲線和溶液標準曲線評估。ME/%=空白基質中標準物質的峰面積/溶劑中標準物質的峰面積×100。當ME在80%～120%范圍內時，ME被認為可以忽略。ME大于120%表示信號增強，而ME小于80%表示信號抑制[6,26-27]。不使用任何凈化方式，直接將備用液進行UPLC-MS/MS檢測，會導致ME值很低（42.0%～62.0%）（圖7），表明存在信號抑制。相比之下，使用僅經過羧基修飾的MCM-41@COOH材料，部分藥物的ME值得到了改善，如AKH、KNM的ME值在80%～120%的合理范圍內，但GTC的ME值高達229.9%。在羧基化填料的基礎上，同時引入了C18基團，這時目標物產生的ME值范圍為78.0%～120.0%，說明雙官能化的MCM-41@COOH@C18的材料在基質凈化方面更有優勢。將合成的MCM-41@COOH@C18吸附劑與商業產品WCX（3 mL/60 mg，Waters）進行比較。如圖7所示，由于WCX SPE柱是陽離子交換柱，它的ME值為72.0%～114%，主要是因為它可以選擇性地吸附堿性目標物，而用水和甲醇洗滌可以排除中性和脂類化合物。因此，混合模式SPE在降低ME方面與商業WCX SPESPE柱相當，說明合成的MCM-41@COOH@C18具有顯著的改善ME的效果。從理論上講，混合模式吸附劑降低ME的能力與大量疏水性、中性等雜質有關，這些雜質可以通過用水和甲醇洗滌去除。

圖7 不同SPE填料對ME的影響Fig.7 Effect of different SPE fillers on matrix effect

2.4 色譜、質譜條件優化

色譜分離上，由于AGs是強極性化合物，在普通反相色譜柱上的保留相當弱。為了在反相色譜柱上有較好的保留，常會在流動相中加入三氟乙酸等離子對試劑[28]，但是離子對試劑會造成基質抑制，損害柱壽命等問題，因此AGs的分離也是檢測人員面臨的挑戰之一。近年來，氨基柱也被廣泛用于AGs的分析[29]。該柱在亞乙基橋雜化的高純硅膠顆粒上鍵合了酰胺基，相較于HILIC柱具有更高的穩定性。本實驗用的是Waters ACQUITY BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，其適用于分離強極性物質。考察純水、甲酸溶液、乙酸溶液、乙酸銨緩沖液作為水相，乙腈作為有機相對AGs的分離效果，發現2 mmol/L的乙酸銨溶液的峰形和靈敏度最佳。在流動相中加入1%的甲酸有助于增強離子化程度，提高靈敏度。在有機相中加入2 mmol/L乙酸銨時，穩定的酸性環境增強了對目標物的洗脫能力，減少拖尾現象[30]。從圖8可以看出，牛奶基質中添加100 ng/mL AGs的色譜圖，目標峰附近沒有明顯的干擾，峰形和響應良好，這表明該實驗條件下可以分離6 種AGs。

圖8 6 種AGs的提取離子流圖Fig.8 Extracted ion current chromatograms of six AGs

AGs結構中含有氨基環醇、羥基和伯胺或仲胺基團等，呈強極性和弱堿性，適合ESI＋掃描模式。選擇100 ng/mL混合標準溶液連續注射進入質譜離子源入口，優化后的質譜條件見表1。

2.5 方法驗證

采用基質匹配標準曲線進行定量，標準曲線質量濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL和500.0 ng/mL，線性方程見表2，相關系數（r）為0.992 7～0.999 5，均呈現良好的線性關系。

表2 6 種AGs的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of six AGs

基于信噪比為3，牛奶中AGs檢出限為0.30～2.50 ng/mL，基于信噪比為1 0 ， 牛奶中A G s 定量限為1.00～10.0 ng/ mL，這完全符合牛奶中AGs檢測的要求。使用低、中、高質量濃度（5、50、200 ng/mL）的加標空白樣品進行回收率實驗考察，結果見表3。每個水平做6 次重復，6 種AGs的平均日內回收率范圍為74.3%～107%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）范圍分別為3.0%～13.3%；日間回收率范圍為77.2%～106%，RSD范圍為2.6%～15.7%。這些結果表明，將合成的MCM-41@COOH@C18填料應用于牛奶中的AGs檢測的準確度和精密度能夠滿足常規監測的要求。

表3 牛奶中添加3 個水平的AGs的回收率和重復性（n=6）Table 3 Recoveries and repeatability RSDs of AGs at different concentrations in spiked milk (n = 6)%

2.6 與已經報道的方法的比較

將所建立的方法與近年來報道的不同基質樣品中的AGs的其他技術進行比較（表4）。報道的文獻主要基于SPE、MDSPE與MS/MS檢測系統的耦合。無論使用哪種SPE類型，報道的吸附劑都是基于分子印跡材料，反相或離子交換的，僅針對單獨吸附模式。相比之下，反相/陽離子交換型吸附劑與AGs的結構相匹配，因此可以通過靜電基團選擇性地吸附目標物，同時利用反相作用有效分離目標物和雜質。在材料制備上，原料成本低廉，合成方式簡單；在目標物檢測方面，所建立的方法覆蓋種類多，能夠同時有效測定6 種AGs，說明合成的MCM-41@COOH@C18對AGs具有良好的吸附和洗脫特性；在方法性能上，AKH、TBC、KNM、GTC、NMC、APC的回收率均在74.3%～107%之間，方法檢出限在同類樣品檢測中也優于其他已報道的方法。

表4 與其他報道的AGs LC-MS/MS檢測方法的比較Table 4 Comparison of the proposed method with other reported methods for detection of AGs

3 結 論

通過兩步反應法合成了MCM-41@COOH@C18介孔材料，并將其作為SPE吸附劑填料用于牛奶中AGs的殘留分析。基于介孔材料的大的外表面積和介孔通道，對其進行羧基和烷基的雙官能團修飾。由于材料上的羧基和氨基之間的離子交換相互作用，通過調節淋洗液將樣品基質進行了凈化，顯示了該合成材料在復雜基質中選擇性富集和純化AGs的巨大能力。為了獲得最佳SPE富集效果，進一步系統優化SPE條件，結果表明在5～500 ng/mL線性范圍內具有良好的回收率和精密度。該方法簡便、經濟、靈敏，可操作性強，已將其成功應用于牛奶樣品中6 種AGs的提取。未來可將該MCM-41@COOH@C18介孔材料作為吸附劑拓展到其他食品基質中。