表面增強拉曼散射技術在快速檢測預包裝干米粉中乙二胺四乙酸二鈉的應用

孔紅星，陳綺瑩，蒙海森，陳瑞玨，馮 軍，程 昊,*

（1.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州螺螄粉工程技術研究中心，廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2.蔗糖產業省部共建協同創新中心，廣西 南寧 530004；3.廣西科技大學醫學部，廣西 柳州 545000）

乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）是一種廣泛使用的食品添加劑。EDTA-2Na分子中含有強配位能力的氨基和羧基，能與食品中微量的金屬離子形成穩定的絡合物，有效地防止由于金屬離子作用而導致的食品褪色、渾濁、變質以及VC氧化[1]。EDTA-2Na因具有較強的絡合能力，對食品有護色、穩定以及抗氧化的作用，能有效地保護食品中的營養成分，而常作為食品添加劑添加到食品中[2]。根據GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》規定，EDTA-2Na允許在果脯、蔬菜罐頭和復合調味品中作為穩定劑、凝固劑、抗氧化劑和防腐劑使用[3]。

隨著食品工業的發展，預包裝柳州螺螄粉因其鮮香酸辣爽的特性，被廣大消費者所熟知。干制米粉作為預包裝柳州螺螄粉的主食，因其順滑且有嚼勁的口感而逐漸受到人們的青睞，但GB 2760—2014中允許大米制品使用的食品添加劑極少[3-4]。然而為了提高預包裝干米粉的口感和延長保質期，個別商家會在干米粉中超量添加食品添加劑——EDTA-2Na，但米粉并不在允許添加EDTA-2Na作為食品添加劑的食品范圍內[5-7]。EDTA-2Na的過量使用，會對上呼吸道、眼睛、黏膜產生影響，甚至會引發嘔吐、腹瀉和急性腹痛等癥狀，對人體健康造成嚴重影響[8]。為了更好地保護預包裝干米粉市場，開發一種可以快速、靈敏地檢測預包裝干米粉中EDTA-2Na的方法很有必要。

目前，檢測食品中EDTA-2Na的方法有氣相色譜-質譜法[9]、化學發光[10-11]、熒光[12]、比色法[13]和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等[14-15]。這些方法盡管檢測結果精確，但樣品前處理繁瑣、檢測過程復雜，對EDTA-2Na的檢出限較高。相關研究[5,7,15]表明，利用HPLC法檢測小麥粉或面粉中EDTA-2Na的檢出限為2.00～11.15 mg/kg，難以滿足微量添加EDTA-2Na的預包裝干米粉的檢測。表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）是一種基于激光光子非彈性散射的振動光譜，由于電磁增強和化學增強使SERS基底與待測物分子結合時會發生表面等離子共振相互作用，而引起拉曼散射增強的現象。SERS光譜是一種可以對痕量分子進行快速、靈敏分析的檢測技術，對待測物具有“指紋圖譜”的優勢，可準確鑒定痕量物質[16-17]。與出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T 3855—2014《出口食品中乙二胺四乙酸二鈉的測定》）使用的液相色譜測定法相比，SERS檢測簡化了前處理過程，無需采用三氯甲烷凈化米粉中的大分子化合物，大大縮短了檢測時間。除此之外，SERS能提供樣品的分子結構信息，因具有靈敏度高、檢測過程快速、便捷等優點，而成為一種可靈敏檢測市售預包裝干米粉中EDTA-2Na添加情況的技術[18]。

磁性銀納米顆粒具有良好的納米核殼結構，磁性核心有利于其富集目標分子并實現快速分離，親水性、生物相容性良好的SiO2層可增強Fe3O4納米粒子的穩定性。除此之外，Fe3O4上密集、均勻沉積的銀納米顆粒（Ag nanoparticles，AgNPs）有利于提高SERS強度，這是由于磁性核心可以調節銀納米粒子的聚集狀態，使其產生更豐富的熱點，熱點內的電磁耦合作用導致電磁場強度增強，從而達到更好的SERS增強效果[19-22]。

本研究制備了具有良好SERS活性的Fe3O4@SiO2@AgNPs，并以其為拉曼基底檢測預包裝干米粉中EDTA-2Na的含量。目前，利用SERS技術檢測預包裝干米粉中EDTA-2Na含量的研究鮮見報道，因此，本實驗建立一種基于SERS的快速、靈敏檢測預包裝干米粉中EDTA-2Na的方法，以滿足簡單、迅速、準確地檢測預包裝干米粉中痕量添加劑——EDTA-2Na的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺螄粉 東莞市一家人食品有限公司、廣西螺霸王食品有限公司、柳州市好歡螺食品有限公司。

EDTA-2Na（分析純）、硝酸銀（分析純）、羅丹明6G（rhodamine 6G，R6G，生物染色劑）、微晶纖維素（(C6H10O5)n，柱層析） 國藥集團化學試劑有限公司；乙二醇（分析純） 成都市科隆化學品有限公司；六水合三氯化鐵（分析純） 臺山市粵僑塑料有限公司；醋酸鈉（分析純） 廣州市金華大化學試劑有限公司；正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、三水合乙酸鉛、五水合硫酸銅、氯化鈉（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；氨水（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮K30（polyvinyl pyrrolidone K30，PVP K30，mw=58 000） 上海麥克林生化科技有限公司；可溶性淀粉（(C6H10O5)n，分析純）天津市登峰化學試劑廠；氯化鉀、抗壞血酸（均為分析純） 廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

XploRA PLUS激光共聚焦拉曼光譜儀 日本Horiba公司；S-4800冷場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；JEOL JEM 2100透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；50 MAX EDS能譜儀 英國牛津儀器公司；D8A A25 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀、INVENIO R傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 材料制備與表征

1.3.1.1 材料制備

Fe3O4@SiO2@AgNPs的制備過程參考文獻[23-25]，具體流程如圖1所示。操作要點如下：

圖1 Fe3O4@SiO2@AgNPs的制備流程圖Fig.1 Schematic diagram of fabrication of Fe3O4@SiO2@AgNPs

1）合成Fe3O4：取1.35 g FeCl3·6H2O與2.7 g醋酸鈉混合于40 mL乙二醇中，磁力攪拌至所有反應物完全溶解，上述混合物在高壓反應釜內190 ℃條件下持續反應10 h，冷卻至室溫，在外加磁場的作用下，用去離子水和無水乙醇交替洗滌產物3～4 次，真空干燥1 h后得到Fe3O4磁性納米粒子。

2）Fe3O4@SiO2的制備：取0.2 g Fe3O4磁性納米粒子超聲分散于60 mL無水乙醇中，在持續超聲條件下加入4 mL去離子水，0.2 mL TEOS和1 mL 25%的氨水。繼續超聲1 h后，每隔1 h加入0.2 mL TEOS，共加4 次。待反應完全后，在外加磁場的作用下，清洗并干燥反應產物，步驟同上，得到Fe3O4@SiO2納米粒子。

3）Fe3O4@SiO2@AgNPs的制備：將0.5 g PVP溶于26 mL無水乙醇中，超聲30 min。精密稱取2 g硝酸銀溶解在12 mL去離子水中，隨后滴加25%氨水，一邊滴加一邊振蕩，直到固體剛好消失停止滴加氨水，并將其加入到含有PVP的無水乙醇溶液中。在上述混合溶液中加入0.2 g Fe3O4@SiO2超聲10 min，在高壓反應釜內120 ℃條件下持續反應4 h。待反應完全后，清洗并干燥反應產物，步驟同上，烘干即得Fe3O4@SiO2@AgNPs。

1.3.1.2 材料表征

采用透射電子顯微鏡對合成材料的形貌結構進行觀察，并使用EDS能譜儀對材料的元素分布進行表征。

利用XRD儀采集材料在掃描角度（2θ）為10°～80°的X射線衍射譜，工作電壓與工作電流分別為40 kV與40 mA。

將干燥的材料與KBr混合研磨后壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀分析材料的結構。

1.3.2 Fe3O4@SiO2@AgNPs的SERS活性

稱取4.79 mg R6G粉末加入去離子水定容到10 mL容量瓶中，而后將母液稀釋到10-4～10-8mol/L。取100 μL Fe3O4@SiO2@AgNPs（1 mg/mL）與100 μL不同濃度的R6G溶液混合，在室溫下超聲30 min，取10 μL混合液滴在干凈的載玻片上，放置在25 ℃、相對濕度22%的環境中，直至溶液水分自然揮發后采集拉曼信號，每個樣品重復3 次取平均值。使用過程中拉曼光譜的各項參數為：激發波長638 nm，10 倍物鏡，積分時間10 s，功率為1.6 mW，累積次數2 次。

1.3.3 EDTA-2Na的SERS檢測

1.3.3.1 EDTA-2Na標準溶液的制備及SERS檢測

稱取0.1 g EDTA-2Na配成質量濃度為10.00 mg/mL的標準儲備溶液。測量前將EDTA-2Na標準溶液稀釋成質量濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μg/mL的EDTA-2Na標準工作溶液。

取100 μL Fe3O4@SiO2@AgNPs（1 mg/mL）與100 μL不同質量濃度的EDTA-2Na溶液混合，在室溫下超聲20 min。取10 μL混合溶液滴在干凈的載玻片上，放置在25 ℃、相對濕度22%的環境中，直至溶液水分自然揮發后進行拉曼檢測，每個樣品重復3 次取平均值。使用過程中拉曼光譜的各項參數與1.3.2節相同。

1.3.3.2 樣品溶液的SERS檢測

制備預包裝螺螄粉干米粉中的EDTA-2Na待測液：參考GB 5009.278—2016《食品中乙二胺四乙酸鹽的測定》配制[25]。

取預包裝螺螄粉干米粉500 g用搗碎機磨成粉末狀，稱取5 g粉末（精確至0.01 g），分成5 份，分別加入10 mL離心管中，每管加入5 mL去離子水，充分渦旋后，超聲20 min。高速離心后將上清液集中到50 mL容量瓶中。在每管沉淀物中加入去離子水重復提取，合并提取液于50 mL容量瓶中，用去離子水定容到50 mL，經0.45 μm濾膜過濾制成干米粉樣品溶液。在干米粉樣品溶液中添加0.20～1.00 mg/kg范圍內的低、中、高三個濃度的EDTA-2Na，取100 μL不同濃度的待測液與Fe3O4@SiO2@AgNPs超聲混合20 min，根據1.3.3.1節方法干燥后進行SERS檢測，拉曼光譜的參數與1.3.2節相同，每個樣品重復3 次取平均值。

1.4 數據統計與分析

實驗結果運用Origin軟件進行繪圖并進行線性擬合，SERS增強因子按下式計算：

式中：EF為增強因子；ISERS為在Fe3O4@SiO2@AgNPs基底上檢測的1×10-8mol/L（CSERS）R6G在1 652 cm-1拉曼位移處的強度；CRaman為能產生普通拉曼信號的R6G濃度（1 mol/L）；IRaman為其在1 652 cm-1特征峰的拉曼強度。

2 結果與分析

2.1 Fe3O4@SiO2@AgNPs的表征

2.1.1 透射電子顯微鏡及X射線能譜（energy dispersive spectrometer，EDS）分析

如圖2所示，Fe3O4@SiO2@AgNPs是通過在Fe3O4表面包覆SiO2層后沉積AgNPs得到的。制備得到的Fe3O4（圖2a）分散良好，尺寸大小均勻，直徑約為490 nm。Fe3O4的EDS元素分析圖（圖2d）表明Fe3O4納米顆粒只有Fe和O元素。Fe3O4包覆SiO2層后，形成了典型的核殼式結構，如圖2b所示，Fe3O4表面包覆著薄而透明的SiO2層，其厚度約為40～50 nm，Fe3O4@SiO2直徑約為600 nm。Fe3O4@SiO2的EDS元素分析圖（圖2e）表明Fe3O4@SiO2納米顆粒含有Fe、O和Si元素，證明Fe3O4成功包覆了SiO2層。如圖2c所示，合成的Fe3O4@SiO2@AgNPs表面粗糙，大小較為均勻，直徑約為660 nm，直徑約50 nm的AgNPs均勻地鋪滿在Fe3O4@SiO2表面。其EDS元素分析圖（圖2f）表明，制備的納米復合材料只存在Fe、Ag、Si和O元素，沒有存在其他元素表明制造的納米粒子純度高。

圖2 Fe3O4（a）、Fe3O4@SiO2（b）和Fe3O4@SiO2@AgNPs（c）的透射電子顯微鏡圖及Fe3O4（d）、Fe3O4@SiO2（e）和Fe3O4@SiO2@AgNPs（f）的EDS分析圖Fig.2 TEM images of Fe3O4 (a), Fe3O4@SiO2 (b) and Fe3O4@SiO2@AgNPs (c) and energy dispersive spectra of Fe3O4 (d), Fe3O4@SiO2 (e) and Fe3O4@SiO2@AgNPs (f)

2.1.2 XRD及傅里葉變換紅外光譜圖分析

分別對Fe3O4、Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@AgNPs采用XRD進行表征，結果如圖3a所示。Fe3O4磁性納米粒子分別在2θ為18.31°、30°、37°、43°、53.4°、56.9°和62.5°處出現衍射峰，分別對應于尖晶石Fe3O4的（111）、（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶格平面，符合Fe3O4標準反射（JCPDS卡號75-1609）[27]。由于覆蓋在Fe3O4上的SiO2是無定形的，在XRD上不會出峰，因此Fe3O4@SiO2的XRD曲線衍射峰與Fe3O4幾乎完全相同。與Fe3O4和Fe3O4@SiO2的XRD曲線相比，Fe3O4@SiO2@AgNPs在2θ為38.3°、44.3°、64.5°和78°處出現4 個額外的峰，與標準銀衍射峰（JCPDS No.4-0783）比較，分別對應于面心立方Ag的（111）、（200）、（220）和（311）晶格平面（標有符號*）[28]，證明銀納米粒子已經成功生長在磁性顆粒的表面。同時，Fe3O4的所有衍射峰在包裹了SiO2層以及沉積了銀納米粒子后仍被保留，證明磁性Fe3O4顆粒結構未被破壞。同時，沒有出現歸屬不明的峰，說明制作過程并未引入雜質。

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@AgNPs的XRD圖譜（a）及傅里葉變換紅外光譜圖（b）Fig.3 XRD spectra (a)and FT-IR spectra (b) of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2@AgNPs

為了進一步確認材料的組成和結構，測量了傅里葉變換紅外光譜。如圖3b所示，585 cm-1處吸收峰為Fe3O4微球的典型帶，這與Fe—O的伸縮振動有關[29]。1 635 cm-l處的峰是水的H—O—H彎曲振動峰。覆蓋二氧化硅層后，Fe3O4@SiO2微球顯示出以1 095、955 cm-1和798 cm-1為中心的新譜帶。1 095、798 cm-1和955 cm-1處的吸收峰分別是Si—O—Si的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰以及Si—OH的彎曲振動吸收峰[30]，表明SiO2成功覆蓋在Fe3O4微球的表面上。由于AgNPs在紅外區域沒有吸收[31]，因此Fe3O4@SiO2@AgNPs的紅外光譜圖與Fe3O4@SiO2微球幾乎相同。

2.2 Fe3O4@SiO2@AgNPs的拉曼光譜分析

2.2.1 Fe3O4@SiO2@AgNPs對R6G的靈敏度檢測

為探究Fe3O4@SiO2@AgNPs的拉曼增強效果，以Fe3O4@SiO2@AgNPs為基底檢測不同濃度R6G的SERS光譜。如圖4所示，隨著R6G濃度增大，拉曼信號顯著增強，增強因子為4.27×108。

圖4 探針分子R6G的SERS光譜圖Fig.4 SERS spectra of Raman probe molecule R6G

2.2.2 EDTA-2Na檢測的定性分析

以Fe3O4@SiO2@AgNPs為SERS基底對1 mg/mL EDTA-2Na溶液進行SERS檢測，結果如圖5所示。EDTA-2Na的拉曼特征峰為930、1 098、1 325、1 400 cm-1和1 625 cm-1，與Guzonas等[31]的研究結果基本一致。930 cm-1處的特征峰分別歸屬為C—C伸縮振動，1 098 cm-1處的特征峰歸屬為C—N伸縮振動，1 325 cm-1處的特征峰歸屬為N—H的彎曲振動，1 400 cm-1處的特征峰歸屬為COO—的對稱伸縮振動，1 625 cm-1處的特征峰歸屬為COO—的不對稱伸縮振動。

圖5 1 mg/mL EDTA-2Na溶液SERS光譜圖Fig.5 SERS spectra of 1 mg/mL EDTA-2Na solution

2.3 方法學驗證

從圖6a可知，1 625 cm-1處的特征峰強度隨著EDTA-2Na標準溶液質量濃度的降低而降低，EDTA-2Na的檢出限為1.75×10-6mg/mL（根據IUPAC推薦的方法即檢出限=3σ/k，σ為標準偏差，k為校準曲線的斜率）。且當質量濃度在1×10-5～1 mg/mL線性范圍內時，1 625 cm-1處的拉曼吸收強度與EDTA-2Na標準溶液的質量濃度對數具有良好的線性關系（圖6b），線性方程為y=3 012x＋16 675，R2為0.994，說明該基底可以實現對低濃度EDTA-2Na的快速分析檢測。

圖6 不同質量濃度EDTA-2Na的SERS光譜圖（a）和EDTA-2Na在1 625 cm－1處的拉曼強度與質量濃度關系圖（b）Fig.6 SERS spectra of EDTA-2Na at different concentrations (a) and linear relationship between Raman intensity at 1 625 cm-1 and logarithmatic concentration of EDTA-2Na (b)

以10-5mg/mL EDTA-2Na為SERS探針，考察SERS增強基底的均一性與重復性。如圖7a所示，對同一批次制備的Fe3O4@SiO2@AgNPs隨機抽取6 個點進行SERS檢測，以EDTA-2Na在1 625 cm-1處的拉曼信號強度計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.37%，顯示出Fe3O4@SiO2@AgNPs良好的均一性。抽取6 組不同批次的Fe3O4@SiO2@AgNPs進行SERS檢測，根據6 組材料在EDTA-2Na 1 625 cm-1處特征峰的平均拉曼信號強度，計算出RSD為4.22%。圖7b的誤差棒表示每組Fe3O4@SiO2@AgNPs在6 個不同測試點處拉曼強度的標準偏差，結合圖7a可知，同批次的Fe3O4@SiO2@AgNPs在不同測試點的拉曼強度接近且每批次之間的拉曼強度差距不大，體現出Fe3O4@SiO2@AgNPs基底良好的均一性和重復性。

2.4 干擾實驗

為考察干米粉中潛在干擾物對SERS基底檢測EDTA-2Na溶液產生的影響，進行抗干擾實驗。以Fe3O4@SiO2@AgNPs為SERS基底，對100 μL 1×10-5mg/mL EDTA-2Na、65 mg/mL淀粉、1.6 mg/mL纖維素、1.82×10-2mg/mL NaCl、3×10-3mg/mL KCl、0.8×10-5mg/mL抗壞血酸、2.5×10-5mg/mL Cu2＋、0.5×10-5mg/mL Pb2＋進行SERS檢測，每個樣品重復3 次取平均值，其在1 625 cm-1處的拉曼強度如圖8所示。結果表明，干米粉中的潛在干擾物在EDTA-2Na 1 625 cm-1特征峰處沒有拉曼峰，不會對EDTA-2Na的SERS檢測產生影響，該檢測方法具有良好的抗干擾能力。

2.5 預包裝干米粉中EDTA-2Na的檢測

抽取3 家公司生產的預包裝干米粉進行前處理，采用SERS對預包裝干米粉樣品溶液進行檢測，在樣品溶液中并均未檢測出EDTA-2Na的拉曼信號。采用HPLC進行輔助檢測，亦未在樣品溶液中檢測出EDTA-2Na，SERS與HPLC檢測的結果一致（表1）。證明3 種預包裝干米粉樣品中均未添加EDTA-2Na。

表1 預包裝干米粉中EDTA-2Na的測定Table 1 Contents of EDTA-2Na in prepackaged dried rice noodle samples determined by SERS and HPLC

2.6 樣品的加標回收檢測

在預包裝干米粉樣品溶液中添加0.20～1.00 mg/kg范圍內的低、中、高三個濃度的EDTA-2Na進行樣品加標回收實驗（圖9），計算得到樣品檢出限為0.1 mg/kg，加標回收率在96.50%～104.67%之間，RSD在1.2%～4.2%范圍內（表2）。結果表明Fe3O4@SiO2@AgNPs基底可應用于預包裝干米粉中EDTA-2Na的檢測，且測定結果可靠。

3 結 論

本實驗建立基于SERS技術快速、靈敏檢測預包裝干米粉中痕量EDTA-2Na的方法。首先利用種子介導法制備了靈敏度高、重復性和均一性較好的Fe3O4@SiO2@AgNPs作為SERS基底，其對R6G的SERS增強因子為4.27×108。使用該SERS基底對預包裝干米粉樣品中的EDTA-2Na進行SERS檢測，檢出限可達0.1 mg/kg，抗干擾能力良好，加標回收率為96.50%～104.67%，RSD為1.2%～4.2%。此外，利用SERS與HPLC同時對預包裝干米粉樣品溶液進行檢測獲得了一致的結果，驗證了SERS法檢測預包裝干米粉樣品中EDTA-2Na的可靠性，證明該方法可實現對預包裝干米粉樣品中低濃度EDTA-2Na的快速分析檢測。結果表明，利用此方法檢測預包裝干米粉中的EDTA-2Na切實可行，可靈敏地檢測市售預包裝螺螄粉干米粉的EDTA-2Na添加情況，更好地維護預包裝干米粉市場，為檢測預包裝干米粉中的食品添加劑——EDTA-2Na提出新的檢驗思路。