糯紅高粱苗期的內生酵母菌多樣性分析

劉雯雯 胡連清 周萬海 ， 魏 琴馮瑞章 趙 鑫 蒙昌廷 張淑瑤

（1宜賓學院，四川省油樟工程技術研究中心，四川 宜賓 644007；2宜賓學院，農林與食品工程學部，四川 宜賓 644007）

糯性高粱主要栽培于我國西南地區（四川、貴州和重慶）［1］，其中四川宜賓的糯紅高梁屬國家地理標志保護農產品，在釀酒逆反應中具有易糊化和易發酵的優勢，這一釀造原料品質形成可能與其內部微生物組成有著密不可分的關系［2］。但目前關于高粱的研究主要集中在營養成分分析和對白酒品質的影響等，極少關注影響植株生長發育和品質形成的內生菌，特別是內生酵母菌的組成和功能。

近年來，在冰川［3］、湖泊［4］及昆蟲［5］等中相繼發現了內生酵母新種，許多學者開始關注內生酵母并開展相關研究。植物內生酵母是定殖于健康植物組織細胞中，不會對宿主植物造成任何損害且形成互惠互利關系的微生物［6］。宿主植物為內生酵母提供營養且穩定的環境條件，而內生酵母通過分泌代謝產物增強植物對不利條件的抵抗能力，保護植物免受病原體的侵襲、維持植株健康狀態［7］。同一植物中內生酵母菌的數量和多樣性相對內生細菌均較少，但酵母菌更易分離培養且長期儲存，在抵抗植物病原體、促進作物生長方面更具優勢［8］。植物組織、品種和外部自然環境等是影響內生酵母菌數量和菌屬組成的關鍵因素［9］，且已有研究證明，內生酵母可生產抗菌劑和生物催化劑等生物化學品，也影響著決定白酒風味和特色的原料品質［10］。因此，對植物內生酵母展開研究具有較大應用價值。雖然目前關于內生微生物的研究呈熱門趨勢，但有關植物內生酵母菌的相關報道仍較少，且在已有研究中，多為冬季小麥［11］、煙草植物［7］、奇異果［12］等物種的報道，而高粱微生物探究更多側重于環境、根際土和內生細菌等［13-14］。微生物種類研究中的純培養法不能完整揭示內部微生物群落組成，但可獲得純菌株用于微生物生理和代謝研究［15］。而高通量測序技術能更全面且準確地反映微生物群落構成和多樣性，從而檢測到難以培養的微生物［16］。

基于此，本試驗借助傳統純培養法和高通量測序技術對宜賓地區五糧濃香型白酒釀造專用糧—糯紅高粱（雜交種金糯粱1 號和地方種青殼洋）苗期不同組織內生酵母菌種類、群落多樣性展開研究，并對分離菌株產酶功能進行初篩，旨在揭示糯紅高梁中內生酵母菌群落組成，挖掘潛在具有較高生產價值的內生菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糯紅高粱品種：雜交種金糯粱1號（A）和地方種青殼洋（B），種植于四川省宜賓市宜賓學院川茶學院試驗農場（東經104°36′33″，北緯28°47′41″），種植和栽培管理技術采用當地糯紅高粱常規方法，待植株長出2 葉后（即苗期），分別采集2 個品種健康的根（R）、莖（S）、葉（L）組織于無菌自封袋中，冷鏈運至實驗室。在超凈工作臺將植物組織取出，根部按照下述步驟完成表面無菌化處理：流水60 min，無菌水2 次，75%乙醇1 min，無菌水1次，5% NaClO 3 min，75%乙醇1 min；莖部為：流水60 min，無菌水2次，75%乙醇0.5 min，無菌水1 次，4% NaClO 4 min，75%乙醇20 s；葉部為：流水60 min，無菌水2 次，75%乙醇20 s，無菌水1 次，3%NaClO 3 min，75%乙醇20 s。將材料分成2 等份，1 份4 ℃條件下保存，用于純培養法分離菌株；1份勻漿后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于基因組DNA 提取和高通量測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 糯紅高梁可培養內生酵母菌的分離與鑒定無菌條件下用手術刀分別將金糯粱1號和青殼洋的根、莖、葉組織切成長約1 cm 小段、1 cm 小段和0.5 cm×0.5 cm 小片，接種至酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrosem，YPD）瓊脂培養基上，每個平板5個樣品，置于28 ℃恒溫培養箱中培養。待長出菌落后，挑選單菌落進行分離純化，直至獲得純凈菌株。同時采用顯微鏡檢法剔除部分菌株，記錄數量。

形態學和生理生化特性鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》［17］，將純化菌株劃線接種于Wallerstein Laboratory 營養瓊脂（wallerstein laboratory nutrient，WLN）上，28 ℃倒置培養10 d。記錄酵母菌落在WLN平板上的顏色、形態、透明度、質地、隆起狀態，完成形態類型分類。根據《微生物分類學》［18］中酵母菌鑒定項目測定菌株的生理生化指標。

26SrDNA D1/D2 區序列擴增分析：取50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（TaKaRa，日本）裂解液于無菌離心管中，用接種環挑取少量單菌落到離心管中輕輕攪拌搖勻。80 ℃水浴加熱15 min，低速離心，取上清液進行基因序列PCR 擴增。引物為NL1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）、NL4（5′-CTTCCGTC AATTCCTTTAAG-3′）。PCR體系為50 μL：10 mmol·L-1引物NL1 和NL4 各1 μL，DNA 模板5 μL，Premix Taq（Ex Taq Version 2.0） 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR 程序：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠擴增目標產物后，送上海生工生物公司測序。在NCBI BLAST 數據庫中比對DNA 序列，選取同源性較高的相關菌株26S rDNA D1/D2 區域序列作為參比分析對象［19］。

1.2.2 糯紅高梁可培養內生酵母產酶特性測定 純化好的菌株接種于待測培養基上，28 ℃培養箱中培養。淀粉酶篩選需用0.1%碘液染色，5 min 內觀察菌落周圍透明圈情況；蛋白酶、脂肪酶篩選直接通過觀察菌落周圍是否存在透明圈；果膠酶篩選用10 g·L-1的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）溶液淹沒培養皿，觀察菌落周圍的光暈；纖維素酶篩選用0.3 g·L-1剛果紅染色后觀察菌落周圍是否有透明圈；酯酶篩選通過觀察菌落周圍的沉淀物（不透明的暈）；以上情況若存在透明圈或不透明暈則為陽性［20］。

1.2.3 糯紅高梁內生酵母DNA 提取與PCR 擴增、測序 內生酵母總DNA 使用E.Z.N.A.@ Soil DNA Kit試劑盒（Omega Bio-Tek，Inc.，美國）進行提取，使用GeneAmp?9700 型PCR 儀（ABI，美國）進行DNA 擴增試驗。對酵母菌26S rDNA D1/D2 區進行擴增，引物為NL1F（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）、NL2R（5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′）。體系共20 μL：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，5 μmol·L-1正反引物各0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH20 補至20 μL。PCR 程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃終延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR擴增及高通量測序工作由上海美吉公司完成。

1.2.4 數據分析 基于上海美吉生物I-Sanger云平臺完成生物信息學分析。使用fastp（v 0.19.6）對原始序列進行質控，Flash（v 1.2.11）通過重疊拼接樣品pairend 雙端序列。Uparse（v 11）根據97%相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體。通過Mothur（v 1.30.2）和Qiime（v 1.9.1）計算Alpha 多樣性和Beta 多樣性距離矩陣，在ANOSIM 組間差異檢驗下進行非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析。使用LEfSe 分析確定引起微生物群落結構組間差異的指示菌。利用FUNGuild（v 1.0）對內生酵母菌分類進行注釋。

2 結果與分析

2.1 糯紅高粱可培養內生酵母菌的分離與鑒定

2.1.1 內生酵母菌的分離純化 從2 個糯紅高梁品種不同組織中共分離到36 株酵母菌（電子附表1），其中金糯粱1 號27 株，青殼洋9 株。按照組織劃分，根、莖、葉分別分離到6、7、23 株酵母菌。不同酵母菌在WLN培養基上的菌落形態差異明顯（圖1）。根據菌落差異性又可將36 株酵母菌初步分為9 類（Ⅰ～Ⅸ），菌落呈粉色、白色、黃色、綠色等（表1），Ⅲ類菌株數目最多。利用不同類型酵母菌對不同碳源分解能力的不同進行生理生化試驗，根據發酵產生氣體和菌液渾濁程度進行區別（電子附表2），可知GA6、GA7、GA8等22 株菌在有氧條件下可同化半乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、木糖醇、松三糖等碳源，而不能利用葡萄糖和乳糖。GA40和GA50表現的生理生化結果相同，GB95和GB105 菌株結果相同，其他菌株同化特征具有獨特性。Ⅲ和Ⅳ類酵母菌在WLN 培養基上顏色相同，形態略有差異，形態Ⅲ表面光滑，而形態Ⅳ表面褶皺，但屬于此2 類菌株的碳源同化試驗結果一致，可能為相同屬。

圖1 內生酵母菌在WLN培養基上的形態（標尺=5 mm）Fig.1 Colony morphology of endophytic yeasts isolated on WLN medium（Scale bar=5 mm）

表2 內生酵母菌的26S rDNA D1/D2序列分析結果Table 2 Analysis results of 26S rDNA D1/D2 sequence of the endophytic yeasts

2.1.2 內生酵母菌26S rDNA D1/D2區序列分析 通過對36 株內生酵母菌26S rDNA D1/D2 序列測序比對及前期的菌株形態學、生理生化結果可知（表2），形態Ⅰ的分子鑒定結果為紅酵母菌屬（Rhodotorula）、Symmetrospora、囊擔菌屬（Cystobasidium），形態Ⅲ的分子鑒定結果為隱球菌屬（Cryptococcus）、漢納酵母菌屬（Hannaella），形態Ⅴ的分子鑒定結果為Naganishia和囊擔菌屬。鑒定為淺黃隱球酵母的形態分布于Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ類。36株內生酵母菌隸屬于1 門3 綱5 目6 科7 屬10 種，分別為紅酵母菌屬（2 種）、Symmetrospora（1 種）、囊擔菌屬（2 種）、擲孢酵母菌屬（Sporobolomyces）（1 種）、隱球菌屬（2 種）、漢納酵母菌屬（1 種）和Naganishia（1 種），其中優勢門為擔子菌門，優勢種為淺黃隱球酵母。金糯粱1 號27 株菌株隸屬于1 門3 綱3 目4 科5 屬，屬類包括隱球菌屬、漢納酵母菌屬、紅酵母菌屬、擲孢酵母菌屬、囊擔菌屬；青殼洋9 株菌株隸屬于1 門3 綱4 目4 科4 屬，屬類包括Symmetrospora、紅酵母菌屬、Naganishia、隱球菌屬，兩個品種共有屬為隱球菌屬、紅酵母屬。按照組織分類，高粱根部6 株酵母菌均為隱球菌屬；莖部7 株酵母菌隸屬于1 門3 綱4 目5 科6屬，屬類包括隱球菌屬、漢納酵母菌屬、Naganishia、囊擔菌屬、紅酵母屬、擲孢酵母菌屬；葉部23 株酵母菌隸屬于1門3綱4目5科5屬，屬類包括隱球菌屬、漢納酵母菌屬、紅酵母菌屬、囊擔菌屬、Symmetrospora，隱球菌屬為根莖葉共有屬。

2.1.3 可培養內生酵母菌產酶特性測定 36 株內生酵母菌產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶和酯酶功能特性測定結果如表3 和電子附圖2 所示，GA1、GB4、GB13、GA21、GB46和GA78產酶功能最多，均能產生4種酶，前5株菌能產生蛋白酶、脂肪酶、果膠酶和纖維素酶，GA78能產生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和酯酶，隱球菌屬菌株在產酶功能菌株中占比最多，為58.82%。

圖2 糯紅高粱不同品種和不同組織內生酵母菌群Alpha多樣性分析Fig.2 Alpha diversity analysis of endophytic yeasts in different varieties and tissues of waxy sorghum

表3 內生酵母菌產功能酶特性Table 3 endophytic yeasts with functional enzyme activities

2.2 糯紅高粱內生酵母菌高通量測序結果

2.2.1 樣品分類操作單元（operational taxonomic units,OTU）分析 對糯紅高粱不同品種和組織樣本進行高通量測序，原始序列經序列質量控制后共得到380 602條高質量測序標簽（clean tags），序列平均長度269 bp。根據97%相似性聚類，共獲得111 個非重復OTU，隸屬于2門83屬。其中，金糯粱1號48個OTU，隸屬于2 門36屬，青殼洋99 個OTU，隸屬于2 門76 屬，兩者共有OTU 36 個，特有的OTU 分別為12 和63 個。按照組織分類，根、莖、葉各有OTU 數為59、75、29 個，其三者共有OTU 8個，特有OTU分別為30、34、3個。

2.2.2 糯紅高粱內生酵母菌Alpha 和Beta 多樣性分析 Alpha 多樣性分析表明，不同糯紅高粱品種和不同組織的酵母菌群落存在差異（圖2）。在品種方面，菌群豐富度Chao 指數、Sobs 指數及菌群多樣性Shannon指數、Simpson指數均無顯著性差異，且青殼洋Chao 指數和Sobs 指數大于金糯粱1 號，說明青殼洋物種總數相對較多。就組織而言，Chao 指數、Sobs 指數和Shannon 指數在根莖葉間無顯著性差異，但根部Simpson 指數顯著大于莖部（P=0.020）。Beta多樣性基于ANOSIM組間差異檢驗下的NMDS 分析（圖3），發現品種間內生酵母菌菌群結構存在差異（R=0.026 2，P=0.356），但不顯著，組織間內生酵母菌菌群結構存在顯著性差異（R=0.386 0，P=0.001）。品種分組和組織分組對內生酵母菌菌群結構的差異均具有一定的解釋意義（stress=0.146、0.149）。

2.2.3 糯紅高粱內生酵母菌群落結構分析 通過圖4可知，在門分類水平上，金糯粱1 號中豐度最高門類為未分類菌門（93.71%），青殼洋中豐度最高門類為子囊菌門（Ascomycota，42.42%）和擔子菌門（26.82%）。從組織分析，根部豐度最高門類為未分類菌門（74.32%），莖部和葉部豐度最高門類分別為擔子菌門（52.50%）和子囊菌門（54.01%）。在屬分類水平上，金糯粱1號中相對豐度最高的屬為未分類菌屬（93.41%）；青殼洋中相對豐度占比大于4%的菌屬依次為未分類菌屬（30.73%）、鐮刀菌屬（Fusarium，19.39%）、絲孢酵母菌屬（Trichosporon，14.43%）和籃狀菌屬（Talaromyces，4.50%）；2個品種共有內生酵母屬為29個。按照組織而言，根中優勢屬為未分類菌屬（74.32%），絲孢酵母菌屬（27.62%）是莖部優勢屬，刺盾炱目未分類屬（unclassified Chaetothyriales，27.27%）是葉部優勢屬。3個組織共有內生酵母屬為枝孢菌屬（Cladosporium）、Cutaneotrichosporon、Pseudozyma、小球腔菌屬（Leptosphaeria）、Microsphaeropsis、Plectosphaerella、鐮刀菌屬、子囊菌門未分類屬和未分類菌屬。因此，苗期糯紅高粱內生酵母的群落組成和相對豐度在品種和組織間存在明顯差異。

圖4 基于門（A、B）和屬（C、D）水平的糯紅高粱不同品種和不同組織內生酵母菌群落結構分析Fig.4 Endophytic yeasts community structure analysis in different varieties and tissues of waxy sorghum based on phylum（A，B） and genus（C，D） level

2.2.4 糯紅高粱內生酵母菌菌群差異分析 LEfSe多級物種層級分析結果顯示（圖5），刺盾炱目未分類科和屬在金糯粱1 號中占相對優勢；微球黑粉菌綱（Microbotryomycetes）在青殼洋中具有相對優勢。按照組織分類，根中糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、Nectriaceae 等12 個菌類占相對優勢；Pichiaceae、擔子菌門和Pichia等8個菌類在莖部樣本中占相對優勢；Tremellales、Rhynchogastremataceae、囊擔菌屬等6 個菌類在葉部樣本中占相對優勢，且這26 個菌類在不同組織間存在明顯差異。

圖5 糯紅高粱不同品種（A）和不同組織（B）內生酵母菌菌群差異分析Fig.5 Microbial community difference analysis of endophytic yeasts in different varieties（A）and tissues（B） of waxy sorghum

2.2.5 糯紅高粱內生酵母菌菌群功能差異分析 基于FUNGuild 數據庫解析高粱2個品種和3個組織內生酵母菌的營養型和生態功能類別，僅選擇可信等級為“可能”和“極可能”的OTU 和分類單元進行分析。由表4 可知，內生酵母菌營養模式可分為6 種，分別為病理型、腐生型、共生型、病理-腐生型、病理-共生型和腐生-共生型。同時可分為16 個生態功能群，金糯粱1 號和青殼洋共有營養型5 種，共有生態功能群5 種，其中青殼洋獨有功能群相對多。按照組織分類，根、莖、葉共有營養型2 個，共有生態功能群2 個。不同組織樣本獨有功能群存在差異，其中莖獨有功能群最多，葉獨有功能群最少，僅有“植物病理菌群”的Eballistra、“真菌寄生菌群”的囊擔菌屬。

表4 糯紅高粱不同品種和不同組織內生酵母菌菌群功能結構Table 4 Functional structure of endophytic yeasts in different varieties and tissues of waxy sorghum

3 討論

本研究基于純培養方法和高通量測序技術，首次對苗期的糯紅高粱內生酵母菌群展開分析和鑒定，結果發現，利用傳統純培養法僅分離到36株內生酵母菌，優勢屬為隱球菌屬，分離結果受品種和組織影響，相對高通量測序技術，純培養方法具有一定局限性［21］。高通量測序雖檢測到隱球菌屬，但豐度較低，且發現存在大量未在純培養方法中獲得的內生酵母菌。本研究通過2 種技術均顯示金糯粱1 號內生酵母菌群落多樣性小于青殼洋，高粱莖部內生酵母菌群落多樣性大于根部和葉部，莖部與根部差異顯著，但韓毅強等［14］研究表明寒區高粱根部的內生真菌群落豐富度和多樣性最高，這可能與研究材料和生長環境差異有關。隸屬于擔子菌門和子囊菌門的酵母菌可棲居在多種極端環境中，許多純培養相關報道獲得的內生酵母菌屬于這兩大門類［22］，本研究也顯示類似結果。進一步分析發現不同組織擔子菌門和子囊菌門酵母菌數量存在差異，如葉部純培養內生酵母中擔子菌門菌株數多于子囊菌門菌株，與Khunnamwong 等［23］和Into 等［24］研究一致，但高通量測序結果顯示，葉部擔子菌門酵母菌株數略低于子囊菌門，可能與分離培養設置條件較少有關，后續還應展開探討。糯紅高粱中還發現了隱球菌屬、擲孢酵母菌屬和紅酵母屬、Saccharomyces和Pichia等較為常見且研究相對多的內生酵母屬［25］，紅酵母屬能通過產生大量類胡蘿卜素抵抗外界不良環境［6］。Saccharomyces可直接影響酒類產量和風味［26］，被應用于生物醫藥、食品、生物能源等領域。Pichia能利用葡萄糖代謝產生乙酸、乙酸乙酯及高級醇等風味物質［27］。羅方雯等［28］通過純培養法和高通量技術從茅臺鎮醬香白酒釀造大曲和環境中篩選到紅酵母屬、隱球菌屬、Saccharomyces和Pichia等酵母菌，與本研究獲得的菌株有相同之處。高通量測序分析菌群結構可知，金糯粱1 號和根部未知類占比較大，說明該品種和根部有較多未知內生酵母菌資源有待深入挖掘，部分未能清晰定性到屬種的酵母菌，將展開深入解析研究。

FUNGuild 數據庫分析發現，不同品種和不同組織間獨有功能群數差異較大。借助生物多樣性保險效應理論［29］，內生酵母營養型功能為宿主適應外界不良環境和形成特異品質提供可能［30］。青殼洋獨有功能群多于金糯粱1 號，莖獨有功能群最多，這與被研究品種特征差異較大是相一致的，但相關機制還需深入探討。值得注意的是，FUNGuild 數據庫僅將絲孢酵母菌屬和Beauveria2 個屬定義為動物病原菌。已有研究顯示某些動物病原菌可跨界侵染不同生物寄主，如高通量分析測定的籃狀菌屬，它可引起人類出現暗色絲孢霉病［31］，因此該菌株應被定義為動物病原菌群。擲孢酵母菌屬被定義為病原-腐生菌，存在于葉和莖中，部分研究表明擲孢酵母菌屬可從蘋果、葡萄等植株的葉片、花和果實中分離得到，造成植物出現病變，但又是促進生物體抗性增加的調控因子［32］。病理型功能群在高粱組織中菌株數排序為莖＞葉＞根，表明病理型功能群在生長旺盛的組織中菌株數較多，可能因莖和葉片具有較高營養物質有關［33］。腐生型功能菌群在根部占比較高，推測可能由于土壤中腐生菌群種類繁多，根長期直接接觸土壤引起腐生型功能菌群的轉移［34］，且腐生型真菌可產生一系列水解酶和氧化酶，有助于碳水化合物的分解，與有機物分解和養分循環相關密切，后續可隨著純培養功能菌株的深入發掘，進一步明確糯紅高粱內生酵母菌的功能。

內生酵母主要依靠新陳代謝與分泌胞外酶等方式適應宿主環境［35］，同時胞外酶能穩定存在于常溫環境中，具有較高催化能力。目前，已有研究對產不同胞外酶的內生酵母菌進行分離純化并投入應用［36］。本試驗中，36 株酵母菌有17 株至少產生1 種及1 種以上的胞外酶，其中金糯粱1 號株數明顯多于青殼洋株數，具有產胞外脂肪酶功能的菌株最多，產淀粉酶、果膠酶和纖維素酶的菌株數最少。這與李治瀅等［37］對云南異龍湖中酵母菌篩選產胞外酶活性結果部分相似，該研究也發現82 株具有產胞外酶功能的菌株中產脂肪酶的最多，說明糯紅高粱中存在可水解脂類、淀粉、果膠、纖維素、蛋白質等天然化合物的酵母菌，參與植株營養吸收和有機物循環，具有重要的生態功能。

4 結論

采用傳統微生物純培養法和高通量測序法研究了宜賓地區釀酒專用糯紅高粱不同品種和不同組織中內生酵母菌的群落結構和多樣性，結果表明，不同品種和組織中蘊含豐富的內生酵母菌資源，具有極大的功能多樣性。不同品種和不同組織的酵母菌群落多樣性和組成存在差異和共性，其中雜交種金糯粱1 號群落多樣性小于地方種青殼洋，莖部內生酵母菌群落多樣性大于根部和葉部，但金糯粱1 號和根部存在更多未知和不可培養菌種。后續應加大測序深度和優化可培養條件獲得更多有利微生物資源，并對功能性菌株開展應用研究。