食品中致病菌的常規(guī)和新興檢測技術(shù)研究進展

陳俊，劉家麒

1.上海市食品研究所有限公司（上海 200235）；2.上海微譜檢測認證有限公司（上海 200441）

近年來，新型細菌檢測工具的變革和發(fā)展不斷進行，把繁重復(fù)雜的科學(xué)工作逐漸由智能儀器替代完成。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是常用的檢測細菌細胞的生物學(xué)方法之一。PCR對于儀器技術(shù)的發(fā)展也有幫助，因為其對各種微生物的檢測具有敏感性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，分子生物學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)等各種新技術(shù)，這些細菌檢測技術(shù)在靈敏度和準確性方面也都得到很大的提升。本文主要論述在食品技術(shù)、食品檢測和微生物學(xué)等領(lǐng)域中出現(xiàn)新趨勢及其實際應(yīng)用，同時介紹傳統(tǒng)的和現(xiàn)代的細菌檢測技術(shù)。相比傳統(tǒng)的檢測方法，現(xiàn)代化新型檢測技術(shù)具有靈敏度高、高效、數(shù)據(jù)準確的優(yōu)勢。

1 傳統(tǒng)生物檢測技術(shù)

1.1 依賴培養(yǎng)的微生物學(xué)方法

生物培養(yǎng)依賴的方法往往耗時長，器械要求高，需要艱苦的勞動。通常需要一個漫長的過程，需要進行樣本采集、選擇合適的媒體和等待適當?shù)呐囵B(yǎng)時間，檢測潛伏期細菌病原體需要18～24 h。在測定細菌的生長速率和殺滅速率時，測定樣品中活菌的數(shù)量是很重要的指標。單個菌落由從一個細胞或一組細胞開始的細菌細胞繁殖組成，每個樣本中細菌的這種定量常稱為菌落形成單位總數(shù)（CFU）。只有在控制條件下即培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、選擇培養(yǎng)基和氧利用度下可培養(yǎng)的細胞才能被計數(shù)。鑒定復(fù)雜樣品中的細菌和病毒在疾病診斷、產(chǎn)品安全和研究中是非常重要的。基于序列的檢測方法已被證明是有用的，并且可以在一次分析中以合理的成本，檢測已測序的數(shù)千種微生物中的任何一種。

1.2 非培養(yǎng)生化檢測技術(shù)

在檢測技術(shù)中，檢測設(shè)備和檢測方法一開始從傳統(tǒng)基于培養(yǎng)的鑒定方法發(fā)展到現(xiàn)在代基于抗原和蛋白質(zhì)檢測的系統(tǒng)，進一步擴展到快速進行分子檢測鑒定。準確快速地鑒定微生物制劑是臨床診斷和食品微生物學(xué)的主要目標。傳統(tǒng)上，從水、廢水和其他環(huán)境樣品中檢測病原體的能力，受到從復(fù)雜的環(huán)境樣品中培養(yǎng)生物體的能力的限制。

1.3 基于核酸序列的免疫檢測技術(shù)

免疫學(xué)和核酸序列檢測技術(shù)被認為是微生物學(xué)中最強大的技術(shù)。其中，變性梯度凝膠電泳是一種利用化學(xué)梯度使樣品（核酸）在丙烯酰胺凝膠上移動的電泳技術(shù)。該技術(shù)通常被用于分離聚合酶鏈反應(yīng)并從中獲得大小相同但具有不同的變性能力的基因，腸道沙門菌和鼠傷寒沙門菌是全世界范圍內(nèi)最廣泛的沙門菌疾病和胃腸道疾病的病原體。對它們進行簡單、靈敏的檢測對生物安全及現(xiàn)場診斷具有重要意義[2]。基于核酸的檢測方法主要是圍繞所有沙門菌的腸道成員16S rRNA基因，這是一種簡單、靈敏、快速的檢測方法[3]。然而，由于16S rRNA序列同源性高，因此特異性區(qū)域少，對此研究人員開發(fā)一種新的核酸依賴性擴增檢測（NASBA）方法，稱為單特異性引物NASBA，其中的特異性反義引物足以進行特定的NASBA反應(yīng)。設(shè)計針對16S rRNA可變區(qū)段的高特異性反義引物和簡并引物，用設(shè)計的引物在單一反應(yīng)環(huán)境中同時特異性檢測兩種病原體，并且檢測限小于10 CFU/mL。開發(fā)的NASBA分析方法應(yīng)該有助于整個檢測過程，并且用于在各種情況下（如疾病暴發(fā)）的病原體檢測。微生物檢測陣列（MDA），已被用于檢測所有已知的病毒（包括噬菌體）、細菌和質(zhì)粒，并開發(fā)一種用于從雜交該陣列的復(fù)雜樣本中識別微生物混合物新的統(tǒng)計方法。應(yīng)用家系特異性探針可以對所有已定序的病毒和細菌全基因組、片段和質(zhì)粒進行檢測。設(shè)計的探針能夠允許一些序列發(fā)生變異，從而能夠檢測出與被測序生物體具有同源性的不同物種，并且與人類基因組序列沒有顯著的匹配。在用單個或多個病毒刺激的樣本進行盲法檢測時，MDA能夠正確識別物種或菌株。在臨床糞便、血清和呼吸樣本中，丙二醛檢測方法是常用的能夠檢測和鑒定樣本中具有多種病毒、噬菌體和細菌的技術(shù)，并通過PCR得到證實。結(jié)論證明丙二醛可用于鑒別復(fù)雜樣品中是否存在的病毒和細菌。

2 現(xiàn)代生化檢測技術(shù)

2.1 生化特性

各種常規(guī)的觀察和生化方法被用于檢測細菌，微生物學(xué)家可通過瓊脂板上的菌落對細菌進行檢測。細菌因其細胞壁結(jié)構(gòu)和組成的不同可分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。其他化學(xué)特性也對細菌鑒定起著重要作用，如糖發(fā)酵、酶的產(chǎn)生和耐藥等，這些都可以很容易地檢測出來。有幾種生化測試可以對任何細菌完成鑒定，如淀粉水解、明膠水解、酪蛋白水解、過氧化氫酶活性、脫氮試驗、硫化氫的生產(chǎn)、細菌樣品的碳源利用譜等。基于核酸序列的檢測技術(shù)比上述生化方法更容易、更可靠，已成為標準和直接的方法。

2.2 免疫檢測技術(shù)

免疫學(xué)方法是建立在抗體與抗原特異性結(jié)合基礎(chǔ)上進行的檢測。在食品調(diào)查中廣泛使用的免疫學(xué)方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]。它可以檢測花生中黃曲霉毒素。另外已有研究將酶聯(lián)免疫吸附試驗與放射免疫測定、免疫擴散、免疫熒光、血凝和免疫電泳進行比較。研究結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫吸附法是目前應(yīng)用于蛇毒研究領(lǐng)域的最通用的免疫分析技術(shù)，其優(yōu)點主要包括具有相對較高的靈敏度和樣品采集的簡便性。它適用于大規(guī)模流行病學(xué)研究和準確地診斷蛇咬傷。酶聯(lián)免疫吸附試驗有助于提高對血吸蟲病的流行病學(xué)知識，其使用抗體和識別顏色變化的物質(zhì)包括酶聯(lián)熒光試劑和免疫磁珠分離（IMS），可以有效檢測從各種樣本中培養(yǎng)的細胞，它可用于量化食物、血液或糞便樣本的致病菌。ELISA是食品診斷中最通用的免疫分析方法。商用ELISA試劑盒主要應(yīng)用于食源性微生物診斷。為開發(fā)更靈敏的方法，將ELISA和免疫磁珠結(jié)合起來，并用熒光團標記，用于細菌的視覺檢測。免疫層析法（如側(cè)流式免疫分析法）在目標顆粒向固定化抗體遷移過程中表現(xiàn)出良好的視覺檢測效果。側(cè)流式免疫層分析法和磁濃度法在2 h內(nèi)可檢測出在奶樣品中添加單核增生乳桿菌濃度。ELISA是一種經(jīng)濟有效的免疫分析方法，可替代簡單的顯微鏡法（廉價法）和高效液相色譜法（昂貴法）。

3 生物傳感器

3.1 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是一種基于化學(xué)修飾石墨烯（傳感器的換能器層）和適配體（傳感層）的電位型適配傳感器。氧化石墨烯和還原氧化石墨烯是構(gòu)建兩種適配傳感器的基礎(chǔ)，用于檢測具有挑戰(zhàn)性的生物，如金黃色葡萄球菌[5]。在這2種適配傳感器中，DNA適配體要么共價的，要么非共價，可附著在換能器層上。在這2種情況下，都能在分析中選擇性地檢測到單個金黃色葡萄球菌，盡管用還原氧化石墨烯制造的噪音水平低于氧化石墨烯制造。但這些新的適配體具有很高的選擇性，其特點是技術(shù)簡單和用于構(gòu)建的材料易于獲得，同時在非常短的時間內(nèi)對微生物的檢測提供極低的檢測限。

3.2 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器在性能上具有很高的選擇性和敏感性，為快速檢測致病菌和各種毒素提供方便。它們具有低檢測限、高輸出篩選、實時分析等特點。納米生物技術(shù)已得到開發(fā)及應(yīng)用，通過整合生物傳感器周圍的各種信號實現(xiàn)對細菌的常規(guī)檢測。光學(xué)生物傳感器被認為是檢測細菌中最聰明的方法，通過對納米孔陣列的堵塞作用與特定的細菌抗體結(jié)合，從而檢測單個細菌細胞，近年來SPR（表面等離子共振）生物傳感器與磁性分離方法相結(jié)合，使用金包裹磁性納米顆粒檢測各種病原菌。SERS（表面拉曼增強光譜）方法被用于多種病原體的高選擇性檢測，為開發(fā)自動組合和微型化方法已開展大量工作，如核酸序列擴增和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，同時設(shè)計多壁板微流控裝置，實現(xiàn)對水中病原體的多重可視化檢測。

4 細菌檢測的儀器技術(shù)

4.1 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)（FCM）是一種生物診斷工具，可以檢測和計數(shù)食品和食品加工過程中的微生物種群。FCM可以提供有關(guān)細胞生理狀態(tài)的信息，并允許在混合培養(yǎng)中計數(shù)微生物。因此，這項技術(shù)越來越多地被用于定量病原體和腐敗微生物檢測。FCM在葡萄酒領(lǐng)域中的應(yīng)用大幅增加，可用于確定微生物在酒精發(fā)酵和蘋果乳酸發(fā)酵過程中的數(shù)量和生理狀態(tài)。基于流式細胞術(shù)的應(yīng)用可用于檢測各種牛奶樣品中的革蘭陽性和革蘭陰性細菌。該技術(shù)可為奶農(nóng)和獸醫(yī)提供關(guān)于革蘭菌類型的現(xiàn)場信息，同時防止乳腺炎病例中不需要的抗菌治療。流式細胞術(shù)應(yīng)用已被用于研究水樣的細菌學(xué)評估和檢測有害和不可培養(yǎng)的細菌[6]。

4.2 氣相色譜和質(zhì)譜分析

分析揮發(fā)性化合物是分析化學(xué)中的一種常見做法，通常用于分析混合物中化合物純度的測試和鑒定。此外，它可用于制備色譜，并從各種化合物的混合物中制備純物質(zhì)。氣相色譜和質(zhì)譜等儀器技術(shù)已被用于分析細菌化合物的微生物鑒定系統(tǒng)。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是一種有效的細菌及其化合物的鑒定和檢測手段。新的微型化技術(shù)，如GC-DMS（氣相色譜微分移動光譜法）被用于檢測大腸桿菌等大腸菌群，這2種技術(shù)GC-MS和GC-DMS可以檢測細菌細胞釋放的各種化合物（如鄰硝基酚和吲哚）。

5 光譜技術(shù)

5.1 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

FTIR是一種基于紅外光譜的技術(shù)，適用于MIR。利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對新鮮肉糜中的生化變化進行測定，可以達到快速監(jiān)測牛肉腐敗的目的[7]。把絞碎的牛肉從新鮮到腐敗的紅外光譜進行測量收集，并進行可行的計數(shù)，主成分分析可以闡明波數(shù)可能與腐敗過程有關(guān)。研究結(jié)果表明，F(xiàn)TIR不受儲存條件（如包裝和溫度）的限制，F(xiàn)TIR光譜可以通過制作代謝指紋圖譜完成檢測，該方法與化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合，是一種強大、快速、經(jīng)濟、無創(chuàng)的監(jiān)測肉糜新鮮度的方法。FTIR光譜被認為是一種快速、準確檢測肉制品中食源性致病菌的生化指紋技術(shù)。通過紅外光束與被激發(fā)分子的振動相聯(lián)系的，由此產(chǎn)生的吸收光譜代表一個特定的指紋，這是任何生化或化學(xué)物質(zhì)的特征。這項技術(shù)可以用來測量食物內(nèi)部發(fā)生的生化變化，提供有關(guān)的信息，了解食物中的微生物代謝物的腐爛和形成。

5.2 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜是一種光譜技術(shù)，在給定的系統(tǒng)中使用振動、旋轉(zhuǎn)和其他低頻模式進行檢測。它利用了激光在一定范圍內(nèi)彈性散射的效應(yīng)與樣本分子之間的相互作用。利用拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對冷凍豬肉的脂質(zhì)氧化程度進行快速檢測研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍豬肉過氧化值與貯藏時間具有顯著相關(guān)性，采用拉曼光譜技術(shù)可以快速測定冷凍豬肉的酸價和過氧化值[8]。用測試樣本挑戰(zhàn)這個數(shù)據(jù)庫。在食品和醫(yī)學(xué)中，拉曼光譜可作為檢測完整的細菌細胞的有效工具，同時可以在幾秒鐘內(nèi)記錄光譜，利用各種統(tǒng)計工具在幾分鐘內(nèi)生成結(jié)果。科學(xué)家正試圖通過將光譜技術(shù)與納米陣列相結(jié)合，尋找檢測食品中食源性致病菌的創(chuàng)新方法，以獲得更好的結(jié)果。

5.3 太赫茲輻射技術(shù)

太赫茲（THz）輻射也被稱為太赫茲波和太赫茲光，THz輻射主要用作成像工具，研究半導(dǎo)體等離子體天線表面細菌層間之間的相互作用，THz等離子體天線提高生物材料薄膜的靈敏度極限，使細菌的檢測降低到單層厚度[9]。此外，還可在5種不同的細菌中選擇性地鑒定革蘭菌類型。這種選擇性可以從對雙層細菌的實驗和對單層細菌的多重測量分析中看出。革蘭體之間信號差異的來源很可能是來源于細胞壁的結(jié)構(gòu)差異或菌體內(nèi)物質(zhì)的不同含量。可使用統(tǒng)計方法（如化學(xué)計量學(xué)或分類算法）確定未知樣本的菌種類型，THz作為一種無標簽、低成本、快速的探測和接收技術(shù)，也可用于快速檢測抗生素療效等方面。科學(xué)家設(shè)計各種可攜帶、無標簽和靈敏的技術(shù)，可用于現(xiàn)場微生物調(diào)查，THz輻射就是其中之一。盡管THz光譜技術(shù)被認為是一種很有前途的檢測技術(shù)，但它仍然面臨一些局限性。局限性與太赫茲波長和細菌細胞大小不匹配有關(guān)。可通過使用THz超材料和增加細菌與太赫茲輻射相互作用來克服這一問題，從而提高THZ輻射的靈敏度，使之與細菌細胞更加兼容。此外，THz技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)和其他統(tǒng)計工具相結(jié)合，可以提供更多的自動化和無偏結(jié)果。利用高質(zhì)量的THz系統(tǒng)、高效的超材料及其他有效的統(tǒng)計工具，可提供更具潛力的細菌檢測應(yīng)用平臺[10]。

6 結(jié)語

微生物通常存在于食物、水、土壤、空氣中，甚至存在于動物和人體中，并不是所有微生物都是致病菌。有研究提出一種新穎的現(xiàn)場檢測方法，這種方法不依賴于培養(yǎng)，簡單而且經(jīng)濟：將實時酶傳感器和酶響應(yīng)納米等離子體生物傳感器系統(tǒng)，應(yīng)用于細菌的特異性和選擇性檢測。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)主要用于檢測水、食品等樣品中的細菌和微生物，而這些技術(shù)限制來自復(fù)雜環(huán)境樣品中不可培養(yǎng)的微生物信息。通常，新的診斷方法結(jié)合各種儀器，具有高度的先進性。大多數(shù)技術(shù)是基于免疫學(xué)檢測和電子傳感器進行檢測。傳統(tǒng)檢測技術(shù)雖然足夠靈敏、準確，但往往速度慢、耗時長。在過去的幾十年里，人們做了大量的工作來改進和發(fā)展先進的探測技術(shù)。傳統(tǒng)和常規(guī)的檢測技術(shù)雖然相當準確和可靠，但無法檢測細菌細胞的生存狀態(tài)。一些現(xiàn)代儀器提供關(guān)于快速檢測計數(shù)的細菌細胞生理狀態(tài)的詳細圖像。分子動力學(xué)、化學(xué)計量學(xué)和許多其他檢測方法克服相關(guān)局限性，為這些新興的檢測技術(shù)提供跨學(xué)科和前沿的科學(xué)支持，促進科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。本文介紹了傳統(tǒng)和現(xiàn)代的細菌檢測技術(shù)，也可以看出現(xiàn)代新型檢測技術(shù)具有快捷、準確的優(yōu)勢，如果以后的研究中能夠?qū)z測成本進行優(yōu)化控制，那么更好、更快捷的新型技術(shù)一定能取代傳統(tǒng)方法，并得到廣泛運用。