經血間充質干細胞及其培養液對化療致早發性卵巢功能不全小鼠的治療作用

余柯達，毛佳婷，柴娟，包云，師帥

(金華市人民醫院生殖醫學中心,金華 321000)

早發性卵巢功能不全(POI)是一種常見內分泌疾病,會導致女性不孕,其具有病因復雜及臨床異質性高等特點。POI臨床表現為女性在40歲之前發生閉經,血清卵泡刺激素(FSH)升高、雌激素(E2)下降。POI的病因目前尚不完全明確,與遺傳缺陷、自身免疫和化療損傷等誘因有關[1]。近年來育齡女性癌癥的發病率逐年上升,化療暴露成為了POI的重要誘因[2]。環磷酰胺(CTX)是臨床常用于惡性腫瘤治療的烷化劑,會損傷女性的生殖系統,導致POI的發生[3]。目前對POI的治療手段極為有限,臨床上以激素替代療法(HRT)為主,但無法恢復患者的卵巢功能和生育能力[4]。因此如何安全有效地改善POI患者的卵巢功能、恢復其生育能力是目前臨床上急需解決的重要問題。

近年來,研究發現間充質干細胞(MSCs)移植可有效改善 POI模型動物的卵巢功能及生育能力[5-9],成為了生殖內分泌研究領域的熱點。有研究者從經血中新發現了一種MSCs——經血間充質干細胞(MenSCs)[10-11]。相較于其他MSCs,MenSCs具有取材易、來源廣、含量多等優點,且來源于人體廢棄物,無倫理問題,具有廣闊的基礎研究和臨床應用潛力[12]。本研究探討了MenSCs及其培養液(MenSCs-CM)對CTX誘導的POI小鼠模型卵巢功能的修復作用,為臨床POI的治療提供新的方法。

資料和方法

一、研究對象

1.實驗動物與細胞:健康ICR雌性小鼠,6周齡,SPF級,體質量約27 g,購自杭州子源實驗動物科技有限公司[生產許可證號:SCXK(浙)2019-0004],在恒溫恒濕環境下飼養,提供12 h光照/12 h黑暗環境,正常晝夜節律自由飲食。所有實驗操作經醫院實驗動物管理與使用委員會核準通過。

MenSCs原代細胞由本實驗室從女性志愿者經血中分離培養得到[13]。

2.主要試劑和儀器:CTX(Sigma,美國);卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒(上海江萊生物),雌二醇(E2)ELISA試劑盒(上海江萊生物);蘇木精(Sigma,美國),伊紅(Sigma,美國);TUNEL檢測試劑盒(Roche,美國)。全波長酶標儀(MD,美國);低速自動平衡離心機(湖南湘儀);輪轉式切片機(LEICA,德國);病理組織漂烘儀(常州市郝思琳);顯微鏡(OLYMPUS,日本);隔水式恒溫培養箱(上海躍進)。

二、研究方法

1.MenSCs/MenSCs-CM制備[13]：選擇生長狀態最好的第4代MenSCs,用無血清培養基(Gibco,美國)培養3 d(37℃,5% CO2),收集培養基,此時的培養基即為MenSCs-CM。貼壁的MenSCs用胰蛋白酶(Gibco,美國)消化,無血清培養基洗滌后制成濃度為l×106/ml單細胞懸液,即MenSCs。

2.分組及治療:ICR雌性小鼠經陰道脫落細胞涂片檢查確定小鼠動情周期正常后,隨機分為4組:對照組(n=30)、POI組(n=30)、POI+MenSCs組(n=30)和POI+MenSCs-CM組(n=30)。POI組、POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組給予CTX 50 mg/kg/d腹腔注射,連續注射15 d,構建POI模型[14],對照組腹腔注射同體積的生理鹽水。在POI模型建立的第7天對POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組小鼠分別尾靜脈注入0.6 ml的MenSCs或MenSCs-CM治療,對照組和POI組小鼠注射相等體積的無血清培養基,尾靜脈注射后第3天再注射1次。分別于治療后第7天和第14天進行取材檢測。

3.取材:所有小鼠在取材前兩天進行孕馬血清促性腺激素(PMSG,蘇州蘇牧)注射,使各組的動情周期一致。小鼠處死前,稱取其體重,摘眼球取血,分離血清。處死小鼠后從卵囊內取出卵巢,稱取兩側卵巢重量,計算卵巢臟器系數,卵巢臟器系數=卵巢重量/體重×100%。

4.血清FSH、E2測定:用ELISA法測定血清FSH、E2的含量,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

5.HE染色觀察卵巢形態:小鼠卵巢在4%多聚甲醛中固定過夜,脫水后用石蠟包埋,行常規HE染色,在顯微鏡下觀察卵巢組織和卵泡形態,計數各級卵泡(原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡)[15]。

6. TUNEL法檢測卵巢組織中細胞凋亡:應用試劑盒觀察卵巢組織中細胞凋亡情況,陽性細胞的細胞核為棕黃色或棕褐色染色,計算卵巢組織細胞凋亡指數,凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。

7.小鼠生育能力的觀察:在治療后第7天將雌鼠與證實可育的雄鼠按1∶1進行合籠飼養10 d,觀察小鼠的懷孕和幼崽情況,記錄每窩小鼠的產仔數,并稱取幼崽出生時的體重。

三、統計學分析

結 果

一、各組小鼠卵巢臟器系數和血清性激素檢測結果

治療第7天,POI組的卵巢臟器系數顯著低于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著高于POI組(P<0.05);治療第14天,各組的卵巢臟器系數變化趨勢與治療第7天一致(圖1A)。治療第7天和第14天,POI組的血清FSH水平顯著高于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著低于POI組(P<0.05),POI+MenSCs組顯著低于POI+MenSCs-CM組(P<0.05,圖1B)。治療第7天,POI組的血清E2水平顯著低于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組、POI+MenSCs-CM組與POI組組間比較均無顯著差異性(P>0.05);治療第14天,POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組的血清E2水平均顯著高于POI組(P<0.05),POI+MenSCs組顯著高于POI+MenSCs-CM組(P<0.05,圖1C)。

A:小鼠的卵巢臟器系數;B:血清FSH水平;C:血清E2水平。7 d和14 d分別代表治療7、14 d后;組間相互比較,*P<0.05。圖1 各組小鼠的卵巢臟器系數、血清FSH和E2結果

二、各組小鼠卵巢組織形態學觀察和卵泡計數結果

HE染色結果顯示,對照組卵巢結構完整,可見正常發育、結構整齊、大小不一的各級卵泡;POI組卵泡數量較對照組明顯減少,且大部分發育不良,可見閉鎖卵泡;POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組的卵巢組織較POI組各級卵泡數量增加,閉鎖卵泡明顯減少(圖2)。

圖2 各組小鼠卵巢組織形態學觀察(HE染色,bar=250 μm)

卵巢組織卵泡計數結果顯示,治療第7天和第14天,POI組的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡的數量均顯著少于對照組(P<0.05),閉鎖卵泡數顯著多于對照組(P<0.05);POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡數量均顯著多于POI組(P<0.05),閉鎖卵泡數顯著少于POI組(P<0.05);POI+MenSCs組的初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡數量均顯著多于POI+MenSCs-CM組(P<0.05),閉鎖卵泡數顯著少于POI+MenSCs-CM組(P<0.05)(圖3)。

A:治療7 d后;B:治療14 d后。組間相互比較,*P<0.05。圖3 各組小鼠卵巢組織中各級卵泡計數

三、各組小鼠卵巢組織細胞凋亡水平比較

卵巢組織細胞凋亡結果顯示,凋亡細胞大部分為成熟卵泡周邊及內部的顆粒細胞(GCs)(圖4)。治療第7天和第14天,POI組的凋亡指數顯著高于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著低于POI組(均P<0.05),POI+MenSCs組顯著低于POI+MenSCs-CM組(P<0.05)(圖5)。

紅色箭頭指示凋亡細胞。圖4 各組小鼠卵巢組織細胞凋亡結果(TUNEL染色,bar=25 μm)

7 d和14 d分別代表治療7、14 d后;組間相互比較,*P<0.05。圖5 各組小鼠卵巢組織細胞凋亡指數

四、各組小鼠生育能力比較

小鼠交配實驗結果顯示,POI組的幼崽數顯著少于對照組(P<0.05),POI+MenSCs組和POI+MenSCs-CM組均顯著多于POI組(P<0.05)。各組小鼠的幼崽體重變化趨勢與幼崽數一致(圖6)。

A:產仔數量統計圖;B:幼崽體重統計圖。組間相互比較,*P<0.05。圖6 各組小鼠產仔數量和幼崽體重情況

討 論

MSCs作為一種成體干細胞,具有強大的增殖和自我更新能力,其廣泛存在于骨髓、脂肪和臍帶等組織中[16]。MSCs移植治療為組織修復和功能重建開拓了嶄新的方向。2007年有研究者首次從女性經血中分離得到并鑒定了MenSCs[11]。MenSCs來源于女性經血,經血是一種人體廢棄物,沒有倫理上的相關問題,且意味著可以不斷地從同一個女性志愿者的經血中獲得具有相同遺傳背景的MenSCs,為其理論基礎研究和臨床應用轉化提供了極大的便利。本研究所用從經血中分離得到的MenSCs,具有MSCs典型的形態、細胞表面標志物和生物學特性[13]。

MSCs具有自我更新、可塑性強、低免疫原性等特點,在組織功能重建,機體損傷修復和免疫調節等方面具有重要應用價值,是現代生物醫學領域中的熱點之一[17-18]。本研究結果發現MenSCs尾靜脈注射治療化療所致POI模型小鼠后,卵巢臟器系數增加,血清FSH和E2水平恢復,GCs凋亡顯著減少,生育能力(產仔數和幼崽體重)得到提高,使POI模型小鼠的卵巢結構和功能損傷得到修復。與骨髓間充質干細胞(BMSCs)[5]、羊膜間充質干細胞(AMSCs)[7]、絨毛膜間充質干細胞(CPMSCs)[8]和臍帶間充質干細胞(UCMSCs)[9]等MSCs對化療所致POI治療方面具有一致的效果。表明MSCs移植可改變局部組織反應及其內分泌激素的分泌,改善激素水平,促進卵泡發育,抑制卵巢過多卵泡閉鎖和GCs凋亡,提高卵巢儲備能力,從而修復卵巢功能。但由于移植MSCs治療化療所致POI具有惡變和醫源性感染的風險,以及免疫排斥和穩定安全性等問題,嚴重限制了其在POI治療上的進一步發展。

關于目前MSCs治療POI的主要機制,多數研究認為是其通過旁分泌作用來修復、調節、治療卵巢功能。有研究表明BMSCs[19]、UCMSCs[9]和AMSCs[20]尾靜脈注射POI模型鼠后卵巢功能得以恢復,均未觀察到MSCs向卵巢細胞分化,更多的是通過旁分泌途徑來抑制GCs凋亡,改善卵巢局部微環境,進而恢復卵巢功能。本研究將MenSCs-CM通過尾靜脈注射POI模型小鼠,發現其與MenSCs有一致的治療效果,對血清性激素水平(FSH、E2)恢復和GCs凋亡的改善作用稍差于MenSCs,但對生育能力(產仔數和幼崽體重)的提升作用與MenSCs無顯著差異性。

MSCs在培養過程中會分泌細胞因子和胞外囊泡(EVs)。MSCs分泌的細胞因子,例如血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF),在恢復卵巢功能中起重要作用[21]。Li等[8]研究認為MSCs對POI卵巢的修復作用,是通過其分泌的多種細胞因子組合共同發揮作用,而非單個細胞因子。目前研究表明細胞因子無法充分表現MSCs的功效[22],EVs是旁分泌機制中的重要組成部分,主要由外泌體和微囊泡組成,攜帶具有生物活性的蛋白質、mRNAs和microRNAs(miRNAs)等,參與細胞間的通訊和信號傳導,在組織再生中發揮著重要的作用[23-24]。體外和體內研究均表明MSCs分泌的EVs可有效抑制GCs的凋亡,目前已有研究表明MSCs分泌的EVs攜帶的miR-144-5p、miR-23a、miR-27a、miR-17-5P和miR-320可調控不同通路來抑制GCs的凋亡,恢復POI卵巢功能[25-28]。上述研究表明MSCs分泌的EVs通過自身攜帶的物質可以起到與MSCs類似甚至同樣的治療效果。

我們的實驗仍存在一定的局限性。本研究僅初步探討了MenSCs及其培養液對化療所致POI模型小鼠卵巢功能和生育能力的改善作用,并未對MenSCs治療POI的具體有效分泌產物和分子機制進行探究。因此,接下來MenSCs治療POI的研究,我們將從MenSCs分泌的EVs以及對卵巢功能相關關鍵通路進行更深入的研究。