精子DNA碎片率與男性不育癥患者的年齡、精液分析參數(shù)相關(guān)性研究

張永濤，琚保軍，李霄，姚均超，李魯豫，馬苗苗

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院;2.第一附屬醫(yī)院男科,鄭州 450000)

WHO定義男性不育癥為夫婦同居1年以上,有正常性生活且未采取任何避孕措施,由于男方因素導(dǎo)致女法無法受孕[1]。男性不育癥的病因復(fù)雜,往往是多種病因引起。精液質(zhì)量檢測因其便捷的特點(diǎn)成為評估男性生育能力的基礎(chǔ)檢查[2],然而僅僅依靠精液常規(guī)檢測參數(shù)并不能全面評估男性生育功能,約15%的男性不育癥患者精液質(zhì)量檢測結(jié)果正常[3]。考慮到精液質(zhì)量檢測指標(biāo)只能觀察到精子形態(tài)的完整性,并不能揭示精子所攜帶遺傳物質(zhì)的完整性,因此需要借助另一種實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)一步評估精子中遺傳物質(zhì)的完整性。精子DNA碎片率(DFI)是反應(yīng)男性生育能力的一個更有效的指標(biāo),它能從微觀層面上揭示精子上的形態(tài)和功能的改變[2]。因?yàn)镈NA的完整性對男性生殖有重要作用,精子DNA損傷不僅會影響精液質(zhì)量,還能影響精子功能。本研究通過觀察153例男性不育癥患者DFI與年齡、精液量、前向運(yùn)動(PR)精子、精子總活力[PR精子+非前向運(yùn)動(NP)精子]、精子濃度、精子總數(shù)之間的相關(guān)性,分析DFI是否能反映男性的生殖能力。

一、研究資料與方法

1.研究對象:回顧性分析2021年11月至2022年6月至河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科門診就診的153例男性不育癥患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn):符合男性不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn),年齡為21～51歲;無遺傳病史及家族史,有正常的性生活,無不良生活習(xí)慣;體格檢查(陰莖、陰囊、睪丸、附睪、精索靜脈)未見異常。

排除標(biāo)準(zhǔn):梗阻性無精子癥;因女方因素(輸卵管梗阻、排卵功能障礙、炎癥等)導(dǎo)致的不孕;有陰莖發(fā)育異常、睪丸缺如、精索靜脈曲張等發(fā)育異常的情況;伴有家族遺傳病或染色體核型異常者。

本研究共納入153例患者。根據(jù)患者精液常規(guī)檢測結(jié)果分為兩組:PR精子率為0.98%～32.00%或精子濃度<40×106個/ml,其余精液參數(shù)指標(biāo)正常的為少弱精子癥組(n=74);精液各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)均正常的為精液參數(shù)正常組(n=79)。

2.儀器與試劑:賽司(SAS)精子分析系統(tǒng)(北京賽司醫(yī)療科技);CYTEK流式細(xì)胞儀及基于流式細(xì)胞技術(shù)的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng)(SCSA;無錫廈泰生物科技);離心機(jī)(安徽中科中佳)、恒溫水浴箱、電子秤、量杯、pH試紙、移液槍;SAS精子檢測板(無錫廈泰生物科技);吖啶橙染色液(國為生物科技)。

3.標(biāo)本收集及常規(guī)質(zhì)量檢測:禁欲2～7 d,以手淫的方式將精液收集到無菌量杯內(nèi),之后將標(biāo)本置于37℃恒溫水浴箱,并記錄液化時間[4]。液化后使用SAS精子分析系統(tǒng)檢測精子總活力、PR、精子濃度、精子總數(shù)等精液質(zhì)量指標(biāo)[5]。

4.DFI檢測:取精液標(biāo)本用吖啶橙染色液聯(lián)合流式細(xì)胞儀(無錫廈泰生物科技)檢測精子DFI及精子成熟染色質(zhì)含量。將液化后的精液5 μl移入樣本管中,加吖啶橙染色液試劑盒中的A液稀釋至50 μl,終濃度為1～2×106/ml的精子細(xì)胞;再加B液100 μl,準(zhǔn)確計時30 s后加入C液300 μl,制備完成后混勻,上機(jī)檢測。精子核經(jīng)過酸處理液處理后,再經(jīng)吖啶橙染色,異常精子核染色質(zhì)成單鏈與染料吖啶橙結(jié)合成橙黃色或紅色熒光;正常精子核染色質(zhì)為雙鏈與吖啶橙結(jié)合成綠色熒光。

二、結(jié)果

1.不同精液參數(shù)組精液檢測指標(biāo)比較:本研究共納入符合男性不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的153例患者,年齡為21～51歲,平均年齡為(31.24±4.59)歲。按照精子活力/濃度分為少弱精子癥組(n=74)和精液參數(shù)正常組(n=79)兩組。

兩組間年齡比較無顯著差異(P>0.05);少弱精子癥組精子濃度、精子總數(shù)、精子總活力和PR精子率均顯著低于精液參數(shù)正常組(P<0.05),而 DFI顯著高于精液參數(shù)正常組(P<0.05);其中,少弱精子癥組DFI≤15%比例更低、DFI≥30%比例更高(P<0.05)(表1)。

表1 不同精液參數(shù)組間精液檢測指標(biāo)比較[(-±s),%］

2.不同DFI組間精液檢測指標(biāo)比較:將153例患者根據(jù)不同DFI值分成3個亞組:DFI≤15%組(n=76)、15%

DFI≤15%組的精子總活力和PR精子顯著高于15%

表2 不同DFI組間精液檢測指標(biāo)比較(-±s)

3.精子DFI與年齡、精液檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析:Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,精子DFI與年齡(r=0.244,P=0.002)、精液量(r=0.164,P=0.042)呈正相關(guān);精子DFI與精子濃度(r=-0.254,P=0.002)、精子總數(shù)(r=-0.169,P=0.037)、PR精子率(r=-0.564,P<0.001)、精子總活力(r=-0.585,P<0.001)均呈成負(fù)相關(guān)(圖1)。

圖1 DFI與年齡、精液檢測指標(biāo)相關(guān)性分析圖

三、討論

近幾年的研究發(fā)現(xiàn),男性精液質(zhì)量呈現(xiàn)逐年下降的趨勢,而且男性不育的發(fā)生率逐年上升[6]。男性不育癥是男科中一種較為常見的疾病,其致病原因復(fù)雜、影響因素較多,且臨床上大多數(shù)患者以精液質(zhì)量異常為主,其他癥狀不顯。因此,通過了解精液中精子的濃度、活力等指標(biāo)的精液常規(guī)檢查,可以初步判斷男性的生殖能力。但男性精液質(zhì)量會受到多種因素的影響,僅僅依靠精液常規(guī)檢查可能會影響到男性不育癥的診斷。焦瑞寶等[7]研究發(fā)現(xiàn),選取81例不育癥患者的精液分析,發(fā)現(xiàn)有36例患者精液濃度與活力結(jié)果均正常,約占44.4%。王陽等[8]研究發(fā)現(xiàn),548例男性不育癥患者精液檢測結(jié)果正常的占4.93%。

目前研究發(fā)現(xiàn),精子DNA鏈的完整程度對于評價精子質(zhì)量、提高受精成功率和選取輔助生殖技術(shù)等都具有非常重要的作用。精子DFI是用來評價精子DNA完整性的主要指標(biāo)之一。DNA損傷主要有單鏈斷裂(SSB)和雙鏈斷裂(DSB)兩種形式,但精子DNA損傷的機(jī)制尚未完全明確,現(xiàn)認(rèn)為男性精子DNA損傷的機(jī)制主要分成內(nèi)源性因素與外源性因素。外源性因素包括環(huán)境污染和不健康的生活方式,如長期吸煙、喝酒、熬夜和生殖系統(tǒng)病變(感染、精索靜脈曲張、睪丸扭轉(zhuǎn)等)[9]。內(nèi)源性因素可分成:(1)在生精過程中發(fā)生細(xì)胞凋亡[10];(2)在包裝過程中染色質(zhì)發(fā)生異常[11];(3)在運(yùn)輸過程中受到氧自由基的影響[12]。

本研究結(jié)果顯示,少弱精子癥組精子濃度、精子總數(shù)、精子總活力、PR均顯著低于精液參數(shù)正常組(P<0.05),而DFI顯著高于精液參數(shù)正常組(P<0.05)。這說明DFI升高在一定程度上表現(xiàn)為精子質(zhì)量下降,具體表現(xiàn)為精子濃度、精子總數(shù)、精子總活力、PR等精液指標(biāo)下降。因此,可以從宏觀精液指標(biāo)(精子濃度、精子總數(shù)、精子總活力、PR精子率等指標(biāo))上初步評估男性生育能力,還能從DFI上揭示精子DNA的完整性,評估后期胚胎發(fā)育及是否出現(xiàn)反復(fù)性流產(chǎn)等情況。本研究發(fā)現(xiàn),精液參數(shù)正常組精子DFI≤15%所占比例顯著高于少弱精子癥組(P<0.05),而DFI≥30%所占比例顯著低于少弱精子癥組(P<0.05),說明精子質(zhì)量下降可能與DFI升高有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),不管是外源性因素還是內(nèi)源性因素均可導(dǎo)致DFI升高[9-12],因此要注意生活方式的改變,如避免吸煙、喝酒、長期熬夜、久坐等不良生活習(xí)慣等。

本研究根據(jù)不同DFI值將納入患者分成3個亞組,比較各亞組間精液檢測指標(biāo)發(fā)現(xiàn):與DFI≤15%組比較,15%0.05)。此結(jié)果與部分研究[13-14]結(jié)果不一致,這可能與其研究對象和方法不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),不育癥患者精子DFI與患者年齡呈正相關(guān),這與以往部分研究[14]結(jié)果相似。這應(yīng)當(dāng)與精子DFI隨著年齡的增長而升高有關(guān),DNA損傷修復(fù)機(jī)制并不能完全修復(fù)所有損傷,而且人體自我修復(fù)機(jī)制的能力會隨著年齡的增長而不斷下降[15],未能修復(fù)的DNA損傷一旦存留下來還會影響胚胎質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn),精子DFI與精子濃度、精子總數(shù)、PR精子率、總活力等精液檢測指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān),此結(jié)果與曾蘭等[16]的研究結(jié)果相類似,提示精子DFI具有較好的重復(fù)性,可作為診斷男性不育癥的指標(biāo)[17]。精子細(xì)胞凋亡異常、氧化應(yīng)激反應(yīng)、染色質(zhì)異常均會導(dǎo)致精子DNA損傷,這些因素也會影響精子濃度、精子總數(shù)、精子形態(tài),因此在診斷男性不育癥患者時有必要關(guān)注患者的精子DFI。不育癥患者的精子DFI變化趨勢與精液常規(guī)檢測指標(biāo)的變化相符,說明精子DFI與精子形態(tài)直接相關(guān),也表明精子DFI與精液常規(guī)檢測指標(biāo)(精子總數(shù)、精子濃度、精子總活力、PR精子率)存在著密切聯(lián)系。本研究中精子DFI與精液檢測指標(biāo)中PR精子率、精子總活力呈負(fù)相關(guān),說明精子DNA損傷可能是少弱精子癥的主要因素之一,也可能是男性不育癥的主要因素之一。

在測定方法上,本研究選擇了吖啶橙染色聯(lián)合流式細(xì)胞儀的方法,避免了技術(shù)人員在顏色的判斷上受到主觀因素的影響。但精子DFI測定目前尚未制定統(tǒng)一規(guī)范,Evenson等[18]以生育率為指標(biāo)將精子DFI閾值設(shè)定在25%～30%。本研究按照DFI值分成3個亞組,分組依據(jù)與既往研究[19]相一致。

為了進(jìn)一步探究“精子DFI與精液常規(guī)指標(biāo)的趨勢相近”這一推測,本研究將少弱精子癥組和精液參數(shù)正常組中的DFI值分別計算比例,發(fā)現(xiàn)少弱精子癥組中DFI≤15%占比為32.43%(24/74),顯著低于精液參數(shù)正常組中DFI≤15%的占比[65.82%(52/79)]。但是在精液參數(shù)正常組中有約34.17%的精子DFI值是異常的,說明即使精液常規(guī)檢測指標(biāo)正常時,仍會有一定比例的患者精子DFI結(jié)果不理想。因此,相比與精液常規(guī)檢測,精子DFI能從DNA結(jié)構(gòu)完整性上揭示男性不育癥患者的微觀發(fā)病因素。此外,羅英等[20]研究發(fā)現(xiàn),高DFI對于使用輔助生殖妊娠結(jié)局有不好的影響,甚至部分患者出現(xiàn)反復(fù)流產(chǎn)、妊娠失敗的情況。王金寶等[21]研究發(fā)現(xiàn),DFI>25%時會導(dǎo)致臨床妊娠率顯著降低(P<0.05)。因此,對于不育癥患者檢查精子DFI不僅可以在DNA結(jié)構(gòu)完整性上揭示男性不育癥的微觀因素,還可以對妊娠結(jié)局做出預(yù)測。

綜上所述,精子DFI與精子濃度、精子總數(shù)、PR精子率、精子總活力等精液檢測指標(biāo)直接相關(guān);此外,即使精液指標(biāo)表現(xiàn)為正常的不育癥患者,精子DFI也會出現(xiàn)變化,因此在微觀層面上更好地解釋了精液常規(guī)檢測指標(biāo)正常者中不育癥的影響因素;精子DFI也能為妊娠結(jié)局做出預(yù)測。結(jié)合精液常規(guī)檢測和其他精子檢測指標(biāo),根據(jù)患者情況采取精子DFI檢測可更客觀、更全面地反映男性的生殖能力。但本研究樣本量不足,時間跨度過短,數(shù)據(jù)分析方法不足,還需加大樣本量、拉長時間跨度、深入分析數(shù)據(jù),并進(jìn)行不同地域之間的比較。