蒙藥額爾敦-烏日勒非靶向代謝組學研究*

高 娃，包斯琴，王青亮，都格爾，錫林其其格，烏漢其木格,

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區中蒙醫藥研究院，內蒙古 呼和浩特 010017；3.內蒙古自治區國際蒙醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010065）

蒙藥額爾敦-烏日勒，又名“桑培奴布日布”[1]、欽達穆尼組方[2]、珍寶丸[3]等，由制珍珠、沉香、訶子、紅花等29味蒙藥材組成[4]。其可改善血液濃度，疏通經絡，修復陳舊組織的神經血管損傷[5]，具有清熱安神、舒筋活絡、去黃水、化痰活血、醒腦開竅、消瘀止痛、扶正固本之功效[6-7]。額爾敦-烏日勒是蒙醫治療白脈病、腦出血、腦血栓、神經損傷、神經根炎等疾病的首選藥物[8-9]，在臨床上應用廣泛。如額爾敦-烏日勒與奧拉西坦聯合治療血管性癡呆效果顯著[10]；額爾敦-烏日勒結合西醫治療老年2型糖尿病合并高血壓有明顯療效[11-12]；額爾敦-烏日勒在腦出血治療中有顯著的增益作用[13-15]，可促進微血管增生，保護和改善受損神經功能，改善腦缺血及腦梗死[16-18]；額爾敦-烏日勒還可有效預防和治療神經源炎性痛敏性偏頭痛[19]，但有關其活性成分和作用機理研究相當缺乏。已報道的神經保護活性成分有紅花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、梔子、土木香、木香、蓽茇和黑種草所含16種小分子化合物[20]，但其作用機理尚不明確。揭示其藥效作用機理，明確其入血成分是首要條件。

本研究采用液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）鑒定額爾敦-烏日勒大鼠灌胃給藥后的入血成分，并分析差異代謝物及相關通路，旨在為明確額爾敦-烏日勒的活性成分及作用機理提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠6只，雌雄各半，體質量180～220 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。大鼠購回后，第一時間按雌雄分開飼養于內蒙古國際蒙醫醫院標準動物實驗房。飼養條件：室溫（23±3）℃，相對濕度為40%～60%，明暗周期12 h，大鼠自由攝取動物飼料和飲用純凈水，隔1 d換清潔級墊料。本研究所有程序都是在實驗動物的指導原則下進行的，并得到內蒙古國際蒙醫醫院倫理委員會的批準（批準號：2022-004）。

1.2 藥物與試劑 額爾敦-烏日勒（批號：20190828，規格：60丸/盒）由內蒙古國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中心提供；LC-MS級甲醇（批號：A456-4）、LC-MS級甲酸（批號：A117-50）、色譜級醋酸銨（批號：A114-50）均購于美國Thermo Fisher公司；LC-MS級水（批號：1.15333.2500）購于美國Merck公司。

1.3 主要儀器 Q ExactiveTMHF質譜儀（德國賽默飛世爾公司）；Vanquish UHPLC色譜儀（德國賽默飛世爾公司）；Hypesil Gold column色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）（德國賽默飛世爾公司）；D3024R低溫離心機（美國賽洛捷克公司）。

2 方法

2.1 分組和給藥 將6只SD大鼠隨機分為空白組（KB）和給藥組（ED），每組3只。將大鼠適應性飼養14 d后禁食、不禁水12 h，給藥組大鼠按0.54 g/kg劑量灌胃給予額爾敦-烏日勒，空白組大鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積均為1 mL/100 g。給藥90 min后腹主動脈采血，血液收集在普通采血管中，于室溫靜置1 h進行凝固分層，于室溫下1 610×g離心10 min，取上清液分裝到1.5 mL離心管中，用于后續實驗。

2.2 樣本處理 取100 μL血清樣本置于離心管中，加入400 μL質譜級甲醇，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，于4 ℃條件下15 000×g，離心10 min，取一定量的上清液加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中再次于4 ℃條件下，以15 000×g，離心10 min，收集上清液，進行LC-MS分析。

2.3 儀器參數

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Hyperil Gold column（C18）（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣量為10 μL；正模式：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為甲醇；負模式：流動相A為5 mmol/L醋酸銨，流動相B為甲醇[21]。色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

2.3.2 質譜條件 掃描范圍選擇（m/z）100～1 500；ESI源的設置如下：噴霧電壓為3 200 V；鞘氣流速為40 arb；輔助氣流速為10 arb；離子傳輸管溫度為320 ℃。極性為正極、負極；MS/MS二級掃描為數據依賴性掃描。

2.4 數據處理 將LC-MS原始數據導入Compound Discoverer3.1（CD3.1,Thermo Fisher）搜庫軟件中，進行保留時間、質荷比等參數的簡單篩選，然后對不同樣品根據保留時間偏差0.2 min和質量偏差5 ppm進行峰對齊，使鑒定更準確，隨后根據設置的質量偏差為5 ppm、信號強度偏差為30%、信噪比為3、最小信號強度為100 000、加合離子等信息進行峰提取，同時對峰面積進行定量，再整合目標離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測并與mzCloud、mzVault和Masslist數據庫進行比對，用blank樣本去除背景離子，并對定量結果進行歸一化，最后得到數據的鑒定和定量結果。通過人類代謝組數據庫（human metabolome database，HMDB）和脂質代謝途徑研究計劃（Lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS）數據庫對定量結果進行分類注釋分析。差異代謝產物篩選基于給藥組與空白組比較，以P＜0.05，且log2FC＞0（log2FC＞0為上調、log2FC＜0為下調）為篩選條件納入差異有統計學意義的代謝產物。相關差異代謝通路圖通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進行搜索和分析。代謝途徑分析使用MetaboAnalyst 5.0。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料服從正態分布，采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 實驗數據質量控制 為了對實驗數據進行質量控制，取所有大鼠個體的血清樣品少量，等體積混合均勻后制得質控（quality control，QC）樣本，用于平衡LC-MS系統和監測儀器狀態。通過QC樣品的重現性和穩定性評估儀器狀態，方法及數據的可靠性。結果正、負離子模式下的R2均大于0.98接近于1，說明數據具有良好的可靠性。（見圖1）

圖1 QC 樣本相關性分析

3.2 小分子化合物的非靶向分析 對空白組與給藥組血液成分分別在Compound Discoverer 3.1進行分子式預測并對mzCloud、mzVault和Masslist數據庫同時進行搜庫，鑒定到777個小分子化合物。在正離子模式下，給藥組與空白組大鼠血清中共檢測到491小分子化合物；在負離子模式下，給藥組與空白組血清中共檢測到286個小分子化合物。將上述777個小分子化合物在HMDB數據庫中進行搜索，共發現297個小分子化合物，其中正離子模式下178個、負離子模式下119個。可見正負離子模式下，脂類及非脂類化合物最多。（見圖2）

圖2 HMDB 分類注釋統計圖

基于LIPID MAPS數據庫共鑒定出186個小分子化合物，其中正離子模式下鑒定出78個小分子化合物，負離子模式下鑒定出108個小分子化合物。在HMDB和LIPID MAPS兩個數據庫中同時鑒定到的有73個小分子化合物，其中正離子模式下有37個，負離子模式下有36個，可見甘油磷酰膽堿化合物最多。（見圖3）

圖3 LIPID MAPS 分類注釋統計圖

3.3 差異代謝產物的分析 相對含量分析結果顯示，給藥組與空白組大鼠血清有67個代謝物具有明顯差異，即給藥組有55個代謝物上調，12個代謝物下調。（見表2）由圖4可知，上述67個差異代謝物中大部分化合物的相對含量升高，少數化合物的相對含量降低，差異明顯。（見圖4）

圖4 給藥組與空白組大鼠差異代謝物熱圖

表2 給藥組與空白組大鼠血清差異代謝物（排名前10）

3.4 差異代謝物通路分析 對額爾敦-烏日勒給藥組和空白組篩選的67個差異代謝物進行進一步的KEGG通路富集分析，發現這些差異代謝物共參與11條通路，分別是核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）、甾類激素生物合成代謝（Steroid hormone biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、視黃醇的代謝（Retinol metabolism）、檸檬酸循環代謝（Citrate cycle，TCA cycle）、藥物代謝-細胞色素P450（Drug metabolismcytochrome P450）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（Glycine, serine and threonine metabolism）、不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism），其中富集最多的是核黃素代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成代謝、檸檬酸循環代謝、乙醛酸和二羧酸代謝。（見圖5）

圖5 給藥組與空白組大鼠差異代謝物KEGG 通路富集圖

3.5 額爾敦-烏日勒入血成分的分析 通過對空白組與給藥組血液成分進行單獨搜庫分析對比，結果顯示給藥組血清中鑒定出入血成分共237個小分子化合物，正離子模式下152個，負離子模式下85個。其中，51個是額爾敦-烏日勒原型成分（展示20個成分），如肉豆蔻酸、牛黃熊去氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、雄酮、沒食子酸酯、甘草次酸等，其余186個是額爾敦-烏日勒復方中沉香、牛黃、麝香、丁香、甘草等單藥所含成分產生的代謝產物。（見圖6、表3）

圖6 給藥組大鼠血清中檢測到的小分子化合物分類

表3 額爾敦-烏日勒入血原型成分

4 討論

蒙藥額爾敦-烏日勒是預防和治療心血管及神經系統疾病的常用藥物，并具有神經保護作用，療效顯著。目前，關于額爾敦-烏日勒的有效成分、作用機制及入血成分仍不明確。本研究基于LC-MS非靶向代謝組學方法分析了額爾敦-烏日勒入血成分及潛在作用機制，發現額爾敦-烏日勒給藥后可對多個代謝通路進行干預和調整，如核黃素、膽堿、乙酰膽堿、睪酮等對機體有益的差異代謝物含量升高，給藥后的差異代謝物主要富集于核黃素代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成代謝、檸檬酸循環代謝和乙醛酸和二羧酸代謝等代謝通路。

核黃素又稱維生素B2，是體內黃酶類輔基的重要組成部分[22]。核黃素因其抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等特性而被廣泛研究[23]。有研究表明，核黃素可以預防偏頭痛，減輕局灶性腦缺血損傷的神經保護作用，具有良好的神經保護作用[24-26]。此外，核黃素與其他化合物或藥物的組合可以具有多種作用和保護特性，并在治療中可以減少藥物的毒性作用[23]。本研究結果表明額爾敦-烏日勒對體內核黃素代謝具有一定的調節作用。而這一作用可能與其神經保護作用密切相關。

其次是甘油磷脂代謝，該代謝的紊亂可引起炎癥反應，導致神經元不可逆的損傷。膽堿和乙酰膽堿是甘油磷脂代謝的2個內源性化合物。人的腦組織有大量乙酰膽堿，這是一種重要的中樞膽堿神經遞質，能維持膽堿能系統正常運行和長期記憶的生理基礎，起著神經調節劑的作用[27]。但乙酰膽堿的含量會隨著人年齡的增長而下降。膽堿是合成乙酰膽堿的前體之一。有研究報道，提高神經突觸間隙的神經遞質乙酰膽堿水平，能夠增強神經突觸傳遞效果，改善阿爾茨海默病患者的認知障礙[28-29]。

此外，甾體激素，雄激素和雌激素對認知功能具有重要的影響，可促進學習記憶等認知功能，并降低淀粉樣蛋白在人腦的聚集，可調節海馬未成熟神經元的數量及海馬棘突觸密度，對腦功能具有保護作用[29-30]。檸檬酸循環是糖類、脂肪、蛋白質三大營養物質代謝和能量代謝的樞紐，乙醛酸和二羧酸代謝可看作檸檬酸循環的支路和中間產物的補給途徑[31-32]。這些途徑直接或間接參與體內氧化還原反應和能量代謝等調節。可見額爾敦-烏日勒可對多個代謝通路同時參與和調節，在多個靶點發揮藥效。本研究結果表明，額爾敦-烏日勒可能通過調節內源性代謝物的平衡，發揮調節體內氧化還原平衡及能量代謝的作用。

5 結論

本研究采用LC-MS非靶向代謝組學方法在額爾敦-烏日勒給藥血清中共鑒定出777個小分子化合物，67個差異代謝物。差異代謝物主要富集在核黃素代謝、檸檬酸循環代謝、甘油磷脂代謝等11個相關代謝通路。同時，額爾敦-烏日勒的入血成分有237個，其中代謝產物有186個、入血原型成分有51個。結果可為蒙藥額爾敦-烏日勒的質量控制、潛在活性成分的篩選及作用機理的研究提供重要依據。