基于網(wǎng)絡藥理學多數(shù)據(jù)庫探討“梔子-刺五加”藥對調節(jié)重度抑郁癥的作用機制

楊法智 徐向青

(1.山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院中醫(yī)內科學,山東 濟南 250000;2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內三科、腦病中心,山東 濟南 250000)

抑郁癥是抑郁障礙的一種典型情況,主要表現(xiàn)為疲勞、反應遲鈍、全身疼痛、睡眠障礙等諸多不適,伴或不伴有情緒及情感障礙[1],其中重度抑郁癥(major depressive disorder,MDD)患者甚至可出現(xiàn)輕生行為,是精神科自殺率最高的疾病[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2012年統(tǒng)計,全球約有3.5億抑郁癥患者[3],已成為全球疾病中給人類造成嚴重負擔的重要疾病之一[4]。西藥治療MDD有一定的效果,但副作用也相對較大,臨床應用受到一定的限制。MDD可歸屬于中醫(yī)學的“郁證”“郁病”等范疇[5]。近年來中醫(yī)藥在MDD治療方面日益受到關注,單味中藥、有效單體成分以及中藥復方制劑在抗抑郁治療方面療效顯著,在很大程度上彌補了西藥治療的不足[6-7]。梔子和刺五加是臨床中治療MDD的常用中藥,兩者常配伍出現(xiàn),臨床效果顯著,但兩者作用于MDD的作用機制尚不十分明確[8-9]。為進一步探究“梔子-刺五加”藥對治療MDD的分子作用機制,本研究將基于網(wǎng)絡藥理學的方法篩選“梔子-刺五加”藥對的有效成分,探究其相關作用靶點及通路,為MDD的中醫(yī)輔助治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 “梔子-刺五加”藥對有效成分及作用靶點 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)獲取梔子、刺五加的有效成分,再通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)分別獲取各有效成分的Smile號,將其導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲取其靶點。

1.1.2 MDD疾病靶點 以“major depressive disorder”為檢索詞,設定score≥20,通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)獲取MDD疾病靶點。

1.2 研究方法

1.2.1 交集靶點的獲取 通過Bioinformatic數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/)繪制“梔子-刺五加”有效成分靶點和MDD疾病靶點韋恩圖,并進行分析對比獲取兩者的交集靶點,即為MDD潛在治療靶點。

1.2.2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建及核心成分篩選 將潛在治療靶點對應的成分、藥物匹配后,導入Cytoscape 3.7.2軟件進行“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡圖的繪制,通過Network analyzer工具的Network analysis功能分別獲取成分、靶點的Degree值,并將前5位成分作為關鍵核心成分。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖構建及關鍵靶點篩選 將潛在治療靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)中的Multiple proteins工具,選擇“Homo sapiens”物種,獲取PPI網(wǎng)絡圖文本信息,將文本信息導入Cytoscape 3.7.2軟件,設置靶點寬度(Width)為36、高度(Height)為36,字體大小(Label Font Size)為8.5,得到PPI網(wǎng)絡圖。利用CytoHubba插件對潛在治療靶點進行拓撲分析,以Degree、Closeness、Betweenness算法篩選前10位作為關鍵靶點并進行可視化。

1.2.4 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 通過David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),選擇“Homo sapiens”物種,獲取MDD潛在治療靶點的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析表格數(shù)據(jù)。采用R語言gglopt包根據(jù)-logP值繪制前3位GO、KEGG柱狀圖,前5位KEGG氣泡圖,前5位KEGG靶點通路圖。

1.2.5 MDD的差異表達基因(DEGs)獲取及其差異分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫,以“Major depressive disorder”為檢索詞,獲取GSE76826芯片表達矩陣。將芯片中GSM2038455～GSM2038466設為正常組(Normal組)、GSM2038467～GSM2038476設為MDD模型組(Model組)。通過R語言limma包,以log2(Fold Change)>1且P<0.05為篩選條件對其表達矩陣進行差異分析,獲取MDD的DEGs。去除一個探針對應多個基因的探針,同時保留多個探針對應一個基因的最大探針。聯(lián)合R語言ComplexHeatmap包繪制DEGs火山圖、前30位DEGs熱圖以查看DEGs分布情況,聯(lián)合R語言ggplot2包、umap包繪制PCA圖及UMAP圖以查看樣本間聚類情況,箱式圖以查看樣本間標準化情況。

1.2.6 MDD核心DEGs的獲取及其統(tǒng)計學分析 通過Bioinformatic數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/)繪制潛在治療靶點和MDD的DEGs韋恩圖,以進一步獲取“梔子-刺五加”藥對治療MDD核心差異靶點,即MDD核心DEGs。通過R語言ggplot2包對MDD核心DEGs進行獨立樣本t檢驗,并繪制MDD核心DEGs差異分組比較圖。

2 結果

2.1 “梔子-刺五加”藥對有效成分及作用靶點的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共得到32個梔子有效成分、31個刺五加有效成分。再綜合Pubchem、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫結果,最終得到梔子靶點414個、刺五加靶點405個,去掉重復靶點,最終獲得有效成分靶點572個。

2.2 MDD疾病靶點篩選及潛在治療靶點篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲得MDD疾病靶點10 033個。將“梔子-刺五加”藥對有效成分靶點與MDD疾病靶點取交集,韋恩圖結果顯示共得到潛在治療靶點497個。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”可視網(wǎng)絡圖構建及核心成分篩選 通過Cytoscape 3.7.2軟件對上述潛在治療靶點構建“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡圖,并根據(jù)Degree值篩選出排名前5的核心成分,分別為齊墩果酸(Oleanolic Acid,Degree值138)、熊果酸(Ursolic Acid,Degree值132)、烯醇酸B(Gardenolic Acid B,Degree值79)、5'-五甲氧基黃酮(5-Hydroxy-6,7,3',4',5'-Pentamethoxyflavone5-羥基-6,7,3',4',Degree值55)、梔子黃素(Gardenin,Degree值54)。見圖1。

2.4 PPI網(wǎng)絡圖構建及關鍵靶點篩選 通過PPI網(wǎng)絡圖顯示497個潛在治療靶點的互作關系,再利用CytoHubba插件根據(jù)Degree、Betweenness、Closeness算法進行拓撲分析,分別顯示前10位關鍵治療靶點。見圖2、表1。

表1 靶點拓撲分析結果

圖2 PPI網(wǎng)絡圖及拓撲分析

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共獲取條目3 685個,其中生物過程(BP)3200條,主要通過調控對抗生素的反應、節(jié)律過程、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調控等;細胞組分(CC)151條,主要富集于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等,分子功能(MF)334條,主要參與調控核受體活性、轉錄因子活性、直接配體調節(jié)的序列特異性DNA結合、類固醇激素受體等。KEGG通路富集分析共獲取180條通路,主要通過調控神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路、前列腺癌信號通路等發(fā)揮作用,其中神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路富集ADORA1、ADORA2A、ADORA2B等74個靶點,糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路富集AGTR1、Akt1、CCND1等33個靶點,前列腺癌信號通路富集Akt1、AR、BAD等32個靶點。見圖3。

A為GO、KEGG柱狀圖;B為KEGG靶點通路圖;C為KEGG氣泡圖

2.6 MDD的DEGs獲取及其差異分析 在滿足log2(Fold Change)>1且P值<0.05的條件下,GSE76826芯片共篩選出140個DEGs,其中55個DEGs在MDD組織樣本中高表達,85個DEGs在MDD組織樣本中低表達。根據(jù)log2(Fold Change)進行差異倍數(shù)排序,分別選取MDD組織樣本中高、低表達前30位DGEs繪制差異表達熱圖。PCA圖和UMAP圖顯示GSM2038455～GSM2038476樣本間聚類情況,標準化箱式圖顯示樣本間標準化情況。見圖4。

A為MDD的DEGs火山圖;B為MDD的DEGs熱圖;C為MDD樣本間PCA圖;D為MDD樣本間UMAP圖;F為MDD樣本間標準化箱式圖

2.7 MDD的核心DEGs獲取及其統(tǒng)計學分析 通過Bioinformatic數(shù)據(jù)庫獲取5個MDD的核心DEGs,分別為碳酸酐酶Ⅳ(CA4)、鯤氧化還原酶2(NQO2)、內皮PAS區(qū)域蛋白(EPAS1)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)及麥芽糖酶糖化酶(MGAM)。差異分組比較圖結果顯示,CA4、NQO2、EPAS1、MMP9、MGAM在MDD模型組中均為高表達,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示CA4、NQO2、EPAS1、MMP9、MGAM可作為“梔子-刺五加”調節(jié)的重要靶標。見圖5。

A為MDD的潛在靶點與MDD的核心DEGs韋恩圖;B為CA4差異比較圖;C為NQO2差異比較圖;D為EPAS1差異分組比較圖;F為MMP9差異分組比較圖;G.MGAM差異分組比較圖

3 討論

3.1 “梔子-刺五加”調節(jié)MDD的基礎 中醫(yī)學認為,MDD多因情志失調或體質因素起病,病因多為七情所傷,情志不遂,或郁怒傷肝,病位主要在肝,涉及心、脾、腎。梔子于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為中品,歸心、三焦經(jīng),具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效,能清瀉三焦火熱之毒,瀉心火而除煩[10]。刺五加于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品,歸脾、心、腎經(jīng),具有益氣健脾、補腎安神的功效[11-12]。梔子與刺五加配伍是從心腎角度即“瀉南補北”的中醫(yī)理論角度出發(fā),參與調節(jié)MDD。“瀉南補北”的中醫(yī)治法理論認為,MDD具有“心腎不交、志衰不寧”的特點[13]。心主火而藏神,腎主水而藏志,心腎不交,水火不能交濟,神不能寧,是產(chǎn)生失眠、焦躁等陽性癥狀的主要原因,腎虛志衰則是導致精神情緒低落、生活興趣喪失等陰性癥狀的主要原因[14]。先前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),藥對“梔子-刺五加”配伍在臨床實踐中具有良好的抗抑郁療效,并且符合益水滋腎、清心降火,兼顧調肝的治法[15]。

3.2 “梔子-刺五加”調節(jié)MDD的有效成分 現(xiàn)代研究表明,梔子的主要成分有梔子苷、環(huán)烯醚萜類化合物、西紅花苷、西紅花酸、酚酸類、木脂素類化合物等[16],刺五加的主要成分有苷類化合物、黃酮類化合物、槲皮苷、槲皮素和蘆丁、兒茶酚等[17],這些均具有一定的抗焦慮抑郁和調節(jié)中樞神經(jīng)功能的作用。研究表明,梔子苷、刺五加苷其抗抑郁作用機制與抑制核轉錄因子κB(NF-κB)的活化,并減少促炎細胞因子的含量來抑制神經(jīng)炎癥反應有關[13]。刺五加中黃酮醇類化合物槲皮素可通過抗氧化、抗炎、降低興奮性毒性、升高5-羥色胺水平來發(fā)揮抗MDD作用[18]。梔子中的西紅花苷可以通過增加海馬體中的環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白,包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管生長因子水平而產(chǎn)生抗抑郁作用[19-20]。槲皮苷可通過升高下丘腦阿黑皮素原(POMC) mRNA的水平和血漿β-內啡肽水平,達到抗MDD的效果[9]。本研究結果則顯示,“梔子-刺五加”調節(jié)MDD的作用可能與齊墩果酸、熊果酸、烯醇酸B、5'-五甲氧基黃酮、梔子黃素等成分有關,為將來梔子、刺五加調節(jié)MDD的研究提供方向。

3.3 核心靶點 PPI網(wǎng)絡拓撲分析結果顯示,“梔子-刺五加”調節(jié)MDD與Akt1、ALB、GAPDH、TNF、EGFR、SRC、MAPK3、CASP3、JUN等靶點密切相關,包括了多種蛋白、氨基酸、生長因子等,表明“梔子—刺五加”是通過多渠道、多途徑、多過程參與調節(jié)MDD。MDD的核心DEGs挖掘獲取結果顯示,CA4、NQO2、EPAS1、MMP-9及MGAM“梔子-刺五”加調節(jié)MDD的核心靶。CA4主要表達于神經(jīng)膠質細胞和毛細血管的管腔面,且作用巨大。首先,CA4可以提高一元羧酸轉運蛋白的活性,加快乳酸在神經(jīng)細胞中的吸收,從而促進糖異生,維持大腦能量代謝。其次,內源性的pH值變化會導致離子通道開放或關閉,進而產(chǎn)生神經(jīng)電位差,而CA4則可以提高AE3活性,調節(jié)神經(jīng)細胞內液的pH平衡,防止大腦特別是海馬區(qū)的異常放電[21]。臨床中以失眠癥狀為主的MDD患者比例較高,且腦電圖異常率較高[22],因此CA4可通過防止大腦異常放電參與調節(jié)MDD的過程。研究表明,NQO1的誘導或缺失(敲除)分別與氧化應激敏感性的降低或增加有關。此外,醌還原酶家族的另一個成員NQO2與NQO1功能和結構具有顯著的相似性[23]。近年來有關氧化應激和抑郁關系的研究逐漸增多,表明氧化應激可能是精神類疾病的發(fā)病機制之一,大量研究顯示MDD患者腦中超氧化物歧化酶(SOD)的活性降低,一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量較正常對照組明顯增高[24]。因此推斷,NQO2可能通過調節(jié)氧化應激反應參與MDD的調節(jié)過程。慢性缺氧是導致抑郁發(fā)生的重要環(huán)境因素之一[25]。EPAS1又稱為缺氧誘導因子,是細胞應對缺氧時的關鍵轉錄因子,EPAS1作用的靶基因主要為能量代謝、鐵代謝、血管生長、血管收縮和骨髓造血等相關的基因,這些靶基因中都含有缺氧反應元件(HRE),EPAS1通過識別核心序列5'-TACGTGCT-3'與 HRE結合,從而誘導靶基因的轉錄,介導細胞對缺氧的應答[26]。研究表明,MMP-9可作為中介物質,通過影響神經(jīng)元及其突觸、神經(jīng)遞質、炎性反應、表觀遺傳參與MDD的發(fā)生與發(fā)展[27]。在MDD患者的研究中發(fā)現(xiàn),MMP-9蛋白水解處理海馬中的黏連蛋白-3,在導致社會和認知行為的慢性應激誘導變化過程中發(fā)揮了關鍵作用[28]。目前暫無MGAM參與調節(jié)MDD研究,但本研究中顯示MGAM在MDD組中表達高于正常組,且可下調該分子的表達,因此說明“梔子-刺五加”藥對可能通過作用于該分子的效應途徑干預MDD過程。

3.4 主要通路 KEGG通路富集分析結果顯示,“梔子-刺五加”調節(jié)MDD主要通過調控神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌信號通路發(fā)揮作用。神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路能通過改進神經(jīng)遞質的傳導功能發(fā)揮抗抑郁作用,為質膜上通路的受體及配體[29]。RAGE是在炎癥反應中發(fā)揮促炎性介質的作用,AGEs是RAGE的重要配體,能夠直接或間接介導免疫炎性反應的發(fā)生,損傷神經(jīng)[30]。因此推斷AGE-RAGE信號通路主要通過介導炎性反應減少神經(jīng)損傷來發(fā)揮抗抑郁作用。前列腺癌信號通路包括很多,如前列腺癌Notch信號通路、前列腺癌磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號通路等,有研究表明,PI3K/Akt信號通路可能通過上調VEGF來調節(jié)血管生成,以維持血管通透性,發(fā)揮抗抑郁作用[31]。

總之,“梔子-刺五加”調節(jié)MDD是多成分、多靶點、多通路的復雜過程,主要通過調控CA4、NQO2、EPAS1、MMP-9、MGAM等靶點,為后續(xù)MDD的中藥輔助治療研究提供重要依據(jù)。