Corilagin 對OX-LDL 誘導的HUVECs 細胞損傷的保護作用及對MyD88 信號通路表達的影響

陶代菊，陳 鵬，李雨晴，陳臨宜，楊仁華，何 波，沈志強

（昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以大動脈壁聚集脂質沉積物為主要特征的慢性炎癥性疾病，其發病機理是一個復雜的級聯反應，ox-LDL 的形成和攝取是AS 進展的關鍵步驟[1]。在氧化環境中，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）被氧化修飾為氧化型LDL（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL），ox-LDL 會與內皮細胞以及單核細胞/巨噬細胞上的多種清道夫受體（scavenger receptors，SRs）結合，最終導致在狹窄的動脈粥樣硬化動脈中形成富含血小板和白細胞的凝塊[2]。

蛋白質髓樣分化初級反應蛋白88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）是一種重要的銜接分子，通過下調TLR-4/MyD88/P65 表達，可減輕單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及TNF-α 介導的內皮細胞凋亡和動脈粥樣硬化進展[3-7]。因此，MyD88 信號通路在AS 發生發展過程中扮演著重要的調控作用。

AS 已經成為威脅人類生命健康的主要疾病之一，目前臨床仍缺乏有效的治療藥物[8]。雖然應用他汀類為代表的調血脂藥取得了一定療效，但其嚴重的不良反應限制了其發展。因此，從天然產物中尋找治療AS 的潛在藥物具有重要意義。Corilagin 是一種從Phyllanthus urinaria L.中分離的天然化合物，具有多種藥理作用[9]。研究發現Corilagin 在體內外均能抑制ox-LDL 誘導的血管平滑肌細胞的增殖和遷移[10]，還可降低ox-LDL誘導的HUVECs 的LOX-1 表達水平[11-12]，提示其具有良好的抗AS 作用。本研究將通過MyD88信號通路進一步探討Corilagin 干預對ox-LDL 誘導損傷的HUVECs 細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 細胞人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），購自中國典型物保藏中心。

1.1.2 藥物Corilagin 由中科院昆明植物研究所提供，結構式見圖1，分子量為634.46，純度為99.5%，黃褐色粉狀物，避光密封4℃保存。辛伐他汀原料藥（Q12VK-FO），購自Sigma，分子式C25H38O5，分子量418.57，純度 >99%，防潮低溫避光保存。維生素E（Vit E）原料藥（T-438），購自Sigma，分子式為C29H50O2，分子量為430.71，純度 >99%，白色粉末，-20℃保存。

圖1 Corilagin 的化學結構式Fig.1 Chemical structure of Corilagin

1.1.3 主要試劑OX-LDL 購自廣州奕源生物科技有限公司，MTT-705B054 購自Solarbio 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，TRNzol-A+總RNA 提取試劑裂解液，Golden Taq PCR 試劑盒，TIANScript M-MLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒購自Fermentas 公司，一抗β-actin 購自SAB 公司，MYD88（1∶1 000），P65（1∶500），TNF-α（1：500），MCP-1（1∶1 000）購自愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 藥液配制Corilagin 藥液：用PBS 溶液配制成2 mmol/L 的Corilagin 母液。辛伐他汀藥液：用PBS 溶液配制成10 000 μmol/L 的辛伐他汀母液。維生素E 藥液：用PBS 溶液配制成10 000 μmol/L的維生素E 母液。藥液均臨用前稀釋成所需濃度。

1.2.2 細胞鑒定（1）顯微鏡觀察法：HUVECs 的細胞形態于倒置相差顯微鏡下觀察并拍照；（2）免疫組織化學法：將消毒滅菌后的0.5 cm×0.6 cm蓋玻片放置在6 孔培養板內，并將HUVECs 濃度調整為1×105個/mL，按2 mL/孔接種于6 孔板內。培養至HUVECs 融合80%～90%后，取出蓋玻片。檢測HUVECs 的VIII 因子、CD34的表達，分別分為實驗組和陰性對照組2 組，每組設3 個復孔，按照免疫組化流程處理后，于熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.2.3 MTT 實驗方法將計數后的上述HUVECs接種于96 孔板上，加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h，再用三聯液孵育8 h 后，測定570 nm 和630 nm處的OD 值。

1.2.4 復制ox-LDL 誘導HUVECs 細胞損傷用含EDTA 的胰蛋白酶消化HUVECs，經細胞計數調整濃度為5×104個/mL，100 μL/孔接種到96 孔板內，培養24 h。每次種板4 塊，分別用于探索HUVECs 的損傷時間：6 h、12 h、24 h、48 h，實驗重復3 次。每塊板設正常對照組和ox-LDL 組。正常對照組：加入等量的PBS；ox-LDL 組：分別加入終濃度為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L 的ox-LDL。應用改良MTT 法測定不同損傷濃度及時間條件下ox-LDL 對HUVECs 的損傷程度，以確定ox-LDL 損傷HUVEC 的適宜濃度及時間。

1.2.5 Corilagin 對ox-LDL 誘導損傷的人臍靜脈內皮細胞HUVECs 保護作用觀察用含EDTA 的胰蛋白酶消化HUVECs，經細胞計數調整濃度為5×104個/mL，并以100 μL/孔接種到96 孔板內，培養24 h。每次種板6 塊，重復3 次，每塊板上設9 個組：正常組；模型組；陽性藥組：（Vit E：10 μmol/L、辛伐他汀：1 μmol/L）；Corilagin 給藥組（3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L）。按照分組進行實驗，根據改良MTT 法測定細胞活力，評價Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVECs 的保護作用及其量-效/時-效關系。

1.2.6 RT-qPCR 檢測ox-LDL 損傷的HUVECs 中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 mRNA 的表達將細胞分成正常組，模型組，陽性藥組（Vit E：10 μmol/L、辛伐他汀：1 μmol/L）；Corilagin 組：Corilagin（3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L）一共9 個組。孵育24 h，收集細胞提取總RNA 進行RT-qPCR 定量檢測，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot 檢測ox-LDL 損傷的HUVECs及VSMCs 中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白的表達實驗分組同1.2.6，細胞培養24 h 后，按照分組加入對應的藥物濃度，孵育24 h，所有給藥組給予70 mg/L 的ox-LDL，刺激12 h，將各組細胞分別置于冰上充分研磨后提取總蛋白，總蛋白濃度用BCA 蛋白檢測試劑盒測定。蛋白質樣品用12%、15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜。用無蛋白快速封閉液封閉膜20 min。將PVDF 膜與一抗在4℃孵育過夜，用TBST 洗滌3 次后與二抗孵育2 h。TBST 洗滌3 次，用Bio-Rad 凝膠成像系統顯影、收集和分析靶蛋白的圖像，采用ImageJ 軟件統計數據。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 HUVECs 的鑒定

2.1.1 形態學鑒定倒置顯微鏡下顯示，HUVECs細胞呈扁平的卵圓形、梭形、多角形，細胞均勻透亮，邊界清晰，胞核清晰，呈圓形或橢圓形，有2～3 個核仁。胞漿內含小顆粒，結構完整，符合血管內皮細胞的基本形態，見圖2A～2B。

圖2 HUVECs 形態學鑒定（A×100，B×400）Fig.2 Morphological identification of HUVECs（A×100，B×400）

2.1.2 免疫學鑒定內皮細胞的特異性蛋白CD34、Ⅷ因子既是胞漿蛋白也是胞膜蛋白。通過免疫化學鑒定結果表明，陰性對照細胞形態完整，背景清晰均勻，而陽性組細胞邊界清晰，呈棕紅色，胞漿和胞膜邊緣顏色更深，細胞核明顯，見圖3A。HUVEC Ⅷ因子的陽性表達，見圖3B；CD34 陽性表達，進一步證實培養的細胞為HUVECs，見圖3D。

圖3 免疫組化法檢測HUVECs 細胞Ⅷ、CD34 因子表達（×400）Fig.3 Immunohistochemical detection of factor VIII.and CD34 expression in HUVECs cells（×400）

2.2 OX-LDL 刺激HUVECs 損傷模型

尋找最佳的ox-LDL 刺激HUVECs 損傷模型的條件。結果顯示，隨著ox-LDL 濃度的增加，OD 值下降，說明ox-LDL 對HUVECs 具有損傷作用。與正常對照組比較，刺激6 h，70 mg/L 和80 mg/L 濃度的ox-LDL 明顯損傷了HUVECs（P<0.01）；刺激12、24、48 h，60～80 mg/L 濃度的ox-LDL 明顯損傷HUVECs（P<0.01）。因此，筆者最終選取終濃度為70 mg/L 的ox-LDL 刺激HUVECs 12 h 作為復制ox-LDL 損傷HUVECs 模型的最佳條件，見圖4。

圖4 ox-LDL 對HUVECs 損傷模型的復制（，n=6）Fig.4 Replication of HUVECs damage model by ox-LDL（，n=6）

2.3 Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVECs 的保護作用

與正常對照組比較，ox-LDL 損傷模型組的細胞活力明顯降低（P<0.01）；與模型比較，孵育12 h，6.25～50 μmol/L 的Corilagin 處理組的細胞活力明顯提高，25 μmol/L 的Corilagin 保護作用最明顯，細胞活力較模型組提高50%，50 μmol/L 的Corilagin 組細胞活力與25 μmol/L 組基本持平（P<0.01）；孵育24 h，3.125～50 μmol/L 的Corilagin處理組的細胞活力明顯提高，25 μmol/L 的Corilagin組細胞活力最高，接近正常組水平（P<0.01）；孵育48 h，僅25 μmol/L 和50 μmol/L 的Corilagin 處理組的細胞活力明顯提高，較模型組提高30%（P<0.01），見圖5。這表明，Corilagin 能對ox-LDL 損傷的HUVECs 具有保護作用，其中以25 μmol/L 和50 μmol/L 的濃度效果最顯著。

2.4 Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVECs 中MyD-88、P65、TNF-α、MCP-1 mRNA 表達的影響

與正常對照組比較，ox-LDL 模型組的MyD88、NF-kB、TNF-α、MCP-1mRNA 的表達量顯著升高（P<0.01）。與ox-LDL 模型組比較，不同濃度Corilagin（12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）組和陽性藥組（辛伐他汀、維生素E）的MyD88、P65、MCP-1、TNF-α mRNA 的表達量均顯著降低（P<0.05），見圖6。以上結果表明，Corilagin 可抑制ox-LDL 誘導 HUVECs 的 HUVECs 損傷中的MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 的mRNA 表達。

圖6 Corilagin 對OX-LDL 誘導的HUVECs 中P65、MCP-1、MyD88 和TNF-α 的mRNA 表達的影響（，n=6）Fig.6 Effect of Corilagin on mRNA expression of P65，MCP-1，MyD88 and TNF-α in OX-LDL-induced HUVECs（，n=6）

2.5 Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVECs 中MyD-88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白表達的影響

與正常對照組比較，ox-LDL 模型組MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白表達均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，Vit E 10 μmol/L、辛伐他汀1 μmol/L 組和不同濃度Corilagin（12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）組MyD88、P65、TNF-α、MCP-1 蛋白表達均出現顯著降低（P<0.05），見圖7。以上結果顯示，Corilagin 可抑制ox-LDL 損A：OX-LDL 刺激6 h 對HUVECs 細胞的影響；B：OX-LDL 刺激12 h 對HUVECs 細胞的影響；C：OX-LDL 刺激24 h 對HUVECs 細胞的影響；D：OX-LDL 刺激48 h 對HUVECs 細胞的影響。與正常組相比，**P<0.01。傷的HUVECs 中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1蛋白表達。

圖7 Corilagin 對OX-LDL 誘導的HUVECs 中P65、MCP-1、MyD88 和TNF-α 的蛋白表達的影響（，n=3）Fig.7 Effect of Corilagin on protein expression of P65，MCP-1，MyD88 and TNF-α in OX-LDL-induced HUVECs（，n=3）

3 討論

AS 病程復雜，涉及脂質代謝紊亂和免疫細胞向動脈壁募集等病理過程。他汀類藥物是治療血脂異常的一線藥物，具有降低LDL-C 的功效，然而，部分人對他汀類藥物不耐受，且不良反應較多，限制其使用[13]，因此，尋找安全有效的抗AS 藥物是醫藥學界急需解決的問題。

血管內皮細胞是參與AS 發生發展的關鍵細胞之一，研究選用HUVECs 細胞系，通過鑒定發現該細胞符合血管內皮細胞的形態特征并且高表達血管內皮細胞特異性蛋白CD34 和Ⅷ，提示該細胞系確為HUVECs。目前普遍認為血管內皮細胞的氧化損傷是AS 發展的始動環節，采用ox-LDL 誘導后筆者發現60～80 mg/L 濃度的ox-LDL作用12 h 可使HUVECs 損傷明顯，因此本研究選擇75 mg/L 濃度的ox-LDL 作用12 h 為造模條件。在前期研究中筆者已經發現了Corilagin 抗AS 的作用，本實驗中進一步在細胞水平評價了不同時-效/量-效的Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVECs 的保護作用，結果顯示，Corilagin 在12、24、48 h以濃度依賴的方式（3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L）提高細胞活力，表明Corilagin 對ox-LDL 損傷HUVECs 具有保護作用。

炎性反應貫穿AS 發生發展的全過程，MyD88 是TLR 信號轉導通路的關鍵靶標，在炎癥反應中發揮著重要作用，它通過調控胞漿募集下游的腫瘤壞死因子受體相關因子-6（tumor-necrosis factor receptor associated factor，TRAF-6），誘導TNF-α 和MCP-1 等炎癥因子的表達。Zhu 等[14]研究發現抑制巨噬細胞中TLR4/MyD88/P65 信號通路后小鼠AS 出現轉歸，表明以MyD88 銜接的炎癥反應通路對AS 的進展具有重要調控作用。HUVECs 作為研究內皮細胞功能調節的模型系統，常應用于血管形成、AS 斑塊的研究[15]。本研究以MyD88、P65、TNF-α 和MCP-1 為研究靶標，通過RT-qPCR 和Western blot 技術檢測Corilagin對ox-LDL 誘導的損傷HUVECs 模型中上述因子的表達的影響，在模型組中，MyD88、P65、TNFα 和MCP-1 的表達均明顯上調，而Corilagin 組中這些指標的表達均得到了顯著逆轉。

綜上所述，Corilagin 對ox-LDL 損傷的HUVECs的保護作用可能是通過下調MyD88 基因的表達，抑制p65、炎性因子TNF-α 和趨化因子MCP-1的表達來實現的。本研究沒有采用MyD88 抑制劑佐證Corilagin 通過下調MyD88 信號通路發揮抗AS 作用，因此，在接下來的研究中，筆者將使用MyD88 抑制劑在動物-細胞水平進一步驗證Corilagin 的作用機制，為Corilagin 臨床用于防治AS 提供理論和實驗依據。