氣體信號分子硫化氫介導胃癌多藥耐藥性研究

陳偉毅，胡 柯，劉 雨，彭 靖，李小成，段紹毅，陳立軍，楊騏彰

（1.湖南醫(yī)藥學院醫(yī)學院，湖南 懷化 418000；2.湖南醫(yī)藥學院第一附屬醫(yī)院普外科，湖南 懷化 418000）

胃癌（gastric cancer）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，全國腫瘤中心數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均居所有惡性腫瘤第2 位，已嚴重危害我國居民健康[1]。化療是治療胃癌的主要方法之一，然而胃癌對化療并不敏感，目前應用的多種藥物以及多種給藥方案的總體療效評價很不理想[2]。化療失敗主要是由于胃癌對化療藥物產生了多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）[3]。胃癌多藥耐藥的產生嚴重影響了化療在胃癌治療中的效果，如何逆轉多藥耐藥已成為胃癌治療中的一個關鍵問題。硫化氫（hydrogen sulphide，H2S）是一種新的內源性氣體信號分子，具有多種生理、毒理和藥理作用，如調節(jié)離子通道的開放和關閉、抑制細胞增殖、抗氧化應激、舒張平滑肌、抗內質網應激等[4]。研究表明[5]，H2S 可以促進腫瘤耐藥性，但H2S 對胃癌耐藥性的影響目前尚未明確。本研究擬探討H2S 與胃癌多藥耐藥的關系，為逆轉胃癌多藥耐藥提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 RPMI 1640、胎牛血清（美國Gibco公司），順鉑（齊魯制藥有限公司），阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司），5-氟尿嘧啶（海南卓泰制藥有限公司），CCK8 試劑盒（碧云天公司），BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），NaSH（美國Sigma公司），胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase，CBS）抗體、β-actin 抗體（美國CST 公司）。

1.2 儀器 UV2450 型亞甲基藍分光光度計（日本SHIMADZU 公司），AE2000 型光學倒置顯微鏡（美國Motic 公司），Mini-PROTEAN Tetra 型聚丙烯酰胺垂直電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 細胞及培養(yǎng) 人胃癌MGC803 細胞購于中科院上海細胞庫，用含有10%的胎牛血清的RPMI 1640，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2孵箱中，每48 h 用0.25%的胰酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.4 方法

1.4.1 順鉑誘導多藥耐藥胃癌細胞株的建立 取對數(shù)生長期的胃癌MGC803 細胞，用含1 mg/L 順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后更換為不含順鉑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞恢復活力后，用含相同濃度順鉑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞能夠在含1 mg/L 順鉑的培養(yǎng)基里穩(wěn)定生長。采用同樣的方法將順鉑濃度逐步提高為2、3、4、5 mg/L，最終建立耐5 mg/L 順鉑的胃癌多藥耐藥細胞MGC803/MDR，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.4.2 細胞分組及處理 將MGC803/MDR 細胞隨機分成對照組和氨基氧乙酸（AOAA）組，AOAA 組予以1 mmol/L AOAA 處理24 h，對照組予以等量的培養(yǎng)基處理24 h。另取MGC803 細胞隨機分成對照組和NaSH 組，NaSH 組予以200 μmol/L NaSH 處理24 h，對照組予以等量的培養(yǎng)基處理24 h。

1.4.3 CCK8 法計算IC50值 取對數(shù)生長期的胃癌MGC803 或MGC803/MDR 細胞以每孔1×105/ml，100 μl/孔接種在96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)細胞達到板底80%，分別予以0、1、2、3、4、6 mg/L 順鉑、5-氟尿嘧啶、0、0.5、1、1.5、2 mg/L 阿霉素處理24 h 后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入含10 μl CCK8 的培養(yǎng)液110 μl，同時在空白孔內加入含10 μl CCK8 的培養(yǎng)液110 μl 進行空白對照，繼續(xù)孵育1 h，酶標儀檢測450 nm 出吸光度OD 值，計算細胞活力=（加藥孔OD 值-空白孔OD值）/（不加藥孔OD 值-空白孔OD 值）×100%，采用改良寇式法計算IC50值[6]。

1.4.4 亞甲基藍分光光度計法檢測H2S 含量 取對數(shù)生長期的胃癌MGC803 或MGC803/MDR 細胞以每孔1×106/ml，500 μl/孔接種在24 孔板，收集細胞培養(yǎng)基于含2%醋酸鋅30 μl 離心管中，超聲波裂解細胞后將其置于之前的離心管中，采用亞甲基藍分光光度計法檢測H2S 含量[7]。

1.4.5 Western blot 檢測蛋白表達 提取細胞蛋白，采用BCA 法測量蛋白濃度，每組取60 μg 蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉移到NC 膜上，封閉后加入一抗4 ℃過夜，再加入二抗孵育2 h，曝光顯影，以β-actin 作為內參，采用Quantity one軟件分析蛋白表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以（）表示，兩兩比較采用獨立樣本檢驗，＜0.01 視為統(tǒng)計學意義顯著。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)：MGC803 細胞形態(tài)規(guī)則，呈多邊性或三角形，胞體較大，細胞之間連接緊密，邊界清晰。MGC803/MDR細胞排列松散，細胞之間界限不清，胞體較小，細胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形，見圖1。

圖1 胃癌細胞形態(tài)觀察（×200）

2.2 兩種胃癌細胞株IC50值 MGC803/MDR 細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值高于MGC803細胞（＜0.01），見圖2。

圖2 兩種胃癌細胞株IC50 值

2.3 兩種胃癌細胞株H2S、硫化氫生成酶CBS 表達MGC803/MDR 細胞H2S（91.8±4.36）、CBS（0.85±0.02）表達高于MGC803 細胞（62.53±1.86）、（0.32±0.01）（＜0.01），見圖3。

圖3 兩種胃癌細胞CBS 表達

2.4 AOAA 對MGC803/MDR 細胞H2S 表達和IC50值的影響 采用CBS 抑制劑 AOAA 作用于MGC803/MDR 細胞24 h 后，H2S 生成顯著減少，見圖4A；對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值顯著降低，見圖4B。

圖4 AOAA 對H2S 表達和IC50 值的影響

2.5 NaSH 對MGC803 細胞IC50值的影響 采用NaSH（外源性H2S）作用MGC803 細胞24 h 后，MGC803 細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值顯著升高，見圖5。

圖5 NaSH 對MGC803 細胞IC50 值的影響

3 討論

胃癌多藥耐藥的產生嚴重影響了化療在胃癌治療中的效果，并導致腫瘤復發(fā)和轉移，引起胃癌治療失敗[8，9]。如何逆轉多藥耐藥已成為胃癌治療中的關鍵問題[10]。H2S 是機體內一種新型氣體信號分子，具有分子量小、擴散快、效應廣等特點[11，12]。研究表明，H2S 與腫瘤耐藥形成有關[5]，但其與胃癌多藥耐藥的關系目前尚未明確。本研究擬探討H2S 與胃癌多藥耐藥的關系，為防治胃癌多藥耐藥提供新的思路。H2S 是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后第3 種氣體信號分子，廣泛參與多種生理和病理過程[13，14]。近來越來越多的文獻報道H2S 與腫瘤耐藥相關，如Untereiner AA 等[15]發(fā)現(xiàn)H2S 和CBS 在5-氟尿嘧啶耐藥結腸癌細胞中顯著上調，Bhattacharyya S 等[16]報道CBS 可以促進卵巢癌細胞對順鉑耐藥，Wang L等[17]發(fā)現(xiàn)CBS 過表達可引起肝癌細胞對多柔比星和舒尼替尼產生耐藥。上述研究表明H2S 與多種腫瘤耐藥密切相關，但H2S 與胃癌耐藥的關系尚未明確。

本研究首先采用藥物濃度遞增法建立了胃癌多藥耐藥細胞株MGC803/MDR。通過CCK8 實驗發(fā)現(xiàn)MGC803/MDR 細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值顯著高于MGC803 細胞，表明其具有多藥耐藥性。其次通過亞甲基藍分光光度計法、Western blot 等實驗發(fā)現(xiàn)MGC803/MDR 細胞H2S 含量、H2S生成酶CBS 表達高于MGC803 細胞，表明MGC803/MDR 細胞多藥耐藥性與H2S 生成增多有關。之后采用CBS 抑制劑AOAA 降低MGC803/MDR 細胞H2S后，發(fā)現(xiàn)MGC803/MDR 細胞H2S 生成減少，同時對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值降低，表明抑制H2S 生成可以逆轉MGC803/MDR 細胞的多藥耐藥性。為了進一步驗證H2S 對胃癌多藥耐藥的影響，給予MGC803 細胞NaSH（外源性H2S）處理，發(fā)現(xiàn)在NaSH 的作用下，MGC803 細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值升高，表明增加H2S 生成可以促進MGC803 細胞多藥耐藥性。上述研究結果表明H2S介導了胃癌細胞多藥耐藥性的形成。

有研究報道[18]，內源性H2S 可以促進人胃癌細胞增殖。另有文獻報道[19]，抑制H2S 生成可以減少胃癌血管生成。此外，有資料發(fā)現(xiàn)[20]，降低H2S 生成可以抑制胃癌細胞的增殖、遷移。本實驗發(fā)現(xiàn)升高H2S濃度可以促進胃癌多藥耐藥，降低H2S 濃度可以逆轉胃癌多藥耐藥，表明H2S 介導了胃癌的多藥耐藥，H2S 可能是防治胃癌多藥耐藥的一個新的靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)H2S 介導了胃癌的多藥耐藥的形成，發(fā)掘了胃癌多藥耐藥形成的新機制，為防治胃癌多藥耐藥提供了新的思路。然而，本研究也有一些不足之處，比如只進行了體外細胞實驗驗證，沒有進行體內動物實驗驗證，以及H2S 通過何種途徑介導胃癌多藥耐藥，其機制還需進一步研究。