人參皂苷Rg3 對帕金森病模型大鼠多巴胺能神經元氧化應激的抑制作用

侯曉麗，張亞慧，唐迎樂

（1.揚州市職業大學醫學院，江蘇 揚州 225000；2.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225000）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）的發病機制非常復雜，目前認為其發病機制可能涉及氧化應激、線粒體功能缺陷、環境及遺傳等因素[1]。已有證據表明[2，3]，氧化應激反應和自由基損害在PD 等神經變性疾病中起重要作用。另有研究表明[4]，PD 患者中腦黑質內存在鐵離子濃度升高、線粒體功能下降、抗氧化保護系統如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等功能異常，導致氧化應激反應增強，氧自由基產生過多，引起蛋白質、脂質過氧化損害和斷裂，導致神經元發生凋亡。此外，PD 患者黑質區脂質過氧化產物丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）和過氧化脂質的濃度高于正常10 倍之多[5]。上述研究表明氧化應激參與了多巴胺能神經元的損傷。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）可特異催化GSH 對過氧化氫（H2O2）的還原反應，對細胞結構和功能的完整具有重要的保護作用，GSH-PX 活力的高低直接反映了機體清除自由基的能力[6]。SOD 對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用，它能清除超氧陰離子和自由基而保護細胞免受損傷，其活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力[7，8]。機體產生的氧自由基能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，產生脂質過氧化物，如MDA、羥基、羰基等而引起細胞死亡，故MDA 可反映體內脂質過氧化的程度，從而間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度。人參皂苷-Rg3為祖國傳統中藥人參中分離提純的四環三萜類人參二醇型皂苷單體，研究發現[9，10]，20（S）-Rg3 具有良好的抗腦缺血及神經細胞保護作用。據報道[11，12]，Rg3能使SOD 和GSH-PX 生成增加，而使MDA 產生減少，從而對腦缺血損傷具有保護作用。但有關人參皂苷Rg3 對PD 模型大鼠的保護作用及其分子機制研究較少，基于此，本研究以R-NLC 制備PD 大鼠模型，測定黑質區域MDA 濃度及SOD、GSH-PX 活力，檢測Rg3 對R-NLC 誘導的黑質多巴胺能神經元氧化應激的影響，初步探討Rg3 保護黑質多巴胺能神經元的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SD 成年雄性大鼠24 只，體重（185±20）g，由揚州大學實驗動物中心提供，SPF 級，許可證號：SYXK（蘇）2007-0005，自由飲食飲水及活動。SD 大鼠隨機分為對照組、模型組、Rg3 組和陽性藥物組，每組6 只，分別編號1～6 號。各組大鼠均于造模前3 d 開始給藥，1 次/d，連續31 d，Rg3 組給予6 mg/kg Rg3 灌胃，陽性藥物組給予11 mg/kg 司來吉蘭灌胃，對照組及模型組給予6 mg/kg 羧甲基纖維素鈉CMC-Na 灌胃。灌胃3 d 后除對照組外，其余3 組大鼠均皮下注射魚藤酮納米脂質載體（R-NLC），首劑量給予0.5 mg/kg，第2 次給予0.8 mg/kg，此后每次1 mg/kg，2 d/次，連續28 d，對照組皮下注射同等劑量空白納米脂質載體。

1.2 試劑 人參皂苷Rg3（純度98%）購自吉林大學植化室；鹽酸司來吉蘭片購自南京思科藥業有限公司；羧甲基纖維素鈉購自天津光復精細化工研究所；魚藤酮購自廣東省豐順化工廠；魚藤酮納米脂質載體（R-NLC）為自制；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；冰醋酸、EDTA 等試劑購自北京北化精細化學品有限責任公司。

1.3 儀器設備 使用儀器：普通臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；高速冷凍離心機（5475R，德國Eppendorf 公司）；電子天平（METTLER，AE240，瑞士）；高速均質乳化機（PT-3100，瑞士POLYTRON）；恒溫水浴箱（HH-2，國華電器有限公司）；超凈工作臺（上海潔凈設備廠）；磁力攪拌器（中國南匯電訊器材廠）；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機（寧波新芝科器研究所）；Synergy2 酶標儀（Bio-Tek 公司）；MilliQ plus 超純水系統（Millipore）；超低溫冰箱（-86 ℃，美國Thermo Scientific Revco）。

1.4 大鼠外觀行為表現 根據相關文獻[13]開展對大鼠的行為表現評分，具體評分方式為：若大鼠出現拒捕行為變弱，大鼠毛色變臟變黃，弓背，主動活動減少行為學評分記為1 分；若大鼠出現動作遲緩，有震顫或有步態不穩行為學評分記為2 分；若大鼠步態不能成一條直線前進，且出現單側旋轉行為學評分記為4 分；若大鼠出現單側癱瘓，行走困難，且進食困難行為學評分記為6 分；若大鼠出現完全癱瘓，且不能進食行為學評分記為8 分；若大鼠出現瀕臨死亡或死亡行為學評分記為10 分。

1.5 樣品處理 末次注射后24 h 處死大鼠，迅速取出腦部黑質稱重，低溫下勻漿，制成10%的組織勻漿液，離心（2000 r/min，5 min），取上清待測。

1.6 黑質中MDA 含量及SOD、GSH-PX 活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法測定組織勻漿中SOD、GSH-PX 活力，采用硫代巴比妥縮合法測定MDA 含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學方法 應用SPSS 22.0 統計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），計量資料以（）表示，組間比較采用檢驗，以＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠外觀行為表現評分比較 對照組大鼠外觀行為表現正常；與對照組相比，模型組大鼠出現毛色發黃、姿態不穩的情況，且大鼠會出現弓背狀屈曲體姿，四肢部分或全部出現癱瘓，個別有震顫現象，精神萎靡；與模型組相比，Rg3 組大鼠出現毛色較白，姿態穩定的情況，且均未表現弓背狀屈曲體姿，無四肢部分或全部出現癱瘓，步態正常穩定，精神正常，自發活動較多，與陽性藥物組情況相似；各組大鼠不同時間點行為學評分比較，差異有統計學意義（＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠外觀行為表現評分比較（，分）

表1 各組大鼠外觀行為表現評分比較（，分）

注：與對照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.2 各組大鼠黑質MDA 含量比較 與對照組相比，模型組大鼠黑質MDA 含量升高，差異有統計學意義（＜0.05）；與模型組相比，Rg3 組及陽性藥物組黑質MDA 含量降低，差異有統計學意義（＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠黑質MDA 含量比較（，nmol/mgprot）

表2 各組大鼠黑質MDA 含量比較（，nmol/mgprot）

注：與對照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.3 各組大鼠黑質SOD 活性比較 與對照組相比，模型組大鼠黑質SOD 活性降低，差異有統計學意義（＜0.05）；與模型組相比，Rg3 組及陽性藥物組黑質SOD活性升高，差異有統計學意義（＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠黑質SOD 活性比較（，U/mgprot）

注：與對照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.4 各組大鼠黑質GSH-PX 活性比較 與對照組相比，模型組大鼠黑質GSH-PX 活性降低，差異有統計學意義（＜0.05）；與模型組相比，Rg3 組及陽性藥物組黑質GSH-PX 活性升高，差異有統計學意義（＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠黑質GSH-PX 活性比較（，U/mgprot）

表4 各組大鼠黑質GSH-PX 活性比較（，U/mgprot）

注：與對照組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

3 討論

氧化應激指細胞產生和清除自由基的能力失衡，使被氧化修飾的大分子在細胞內堆積，過量自由基還可以引起生物膜上的不飽和脂肪酸形成過氧化脂質，生成大量MDA，對蛋白質、DNA、RNA 及多糖高分子物質等產生氧化、交聯、變性和降解，導致膜流動性降低、通透性增高、線粒體腫脹、溶酶體釋放生物酶、細胞器及酶的結構和功能破壞。此外，氧化應激可參與脂質過氧化，從而促進PD 的病理過程，目前已在PD 患者的腦內找到氧化應激損傷的證據，包括GSH 水平下降、脂質過氧化增加、多巴醌生成、DNA 損害等[13-15]。

本研究采用R-NLC 構建PD 動物模型，其有助于魚藤酮更好地發揮作用。魚藤酮是一種廣泛應用于農業的殺蟲劑，主要抑制線粒體復合物I，導致機體ATP 合成障礙，小動物如小鼠、大鼠等長期接觸魚藤酮等線粒體復合酶Ⅰ抑制劑可出現類似PD 樣病理學及行為學改變，包括黑質紋狀體DA 能神經元減少等[16]。魚藤酮抑制線粒體后引起氧化應激，而線粒體是細胞對氧化應激最敏感的細胞器，自由基可造成線粒體損傷，線粒體損傷反過來進一步加劇氧化應激。實際上，ROS 是魚藤酮在體內慢性抑制復合體Ⅰ的本質特征[17]。腦組織是機體氧化代謝最活躍的器官，且含有大量易氧化的不飽和脂肪酸，但腦組織內抗氧化相關酶的活性及抗氧化小分子谷胱甘肽的含量較低，特別是在紋狀體和黑質內含有大量的多巴胺，多巴胺在自發的或經酶催化的代謝過程中產生氧自由基、過氧化氫等神經毒性物質[18]。實驗證明[19]，在PD 模型大鼠黑質紋狀體系統受損發生氧化應激的過程中，自由基對生物膜的破壞起了重要作用，使生物膜中的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，產生MDA，生物膜結構及通透性改變，生物酶的活性喪失，線粒體、溶酶體等細胞器發生裂解，細胞死亡。在正常的生理狀態下，人體代謝產生的自由基可以經自由基清除系統滅活。人體清除自由基的酶主要包括SOD、過氧化氫酶（CAT）、GSH-PX及抗氧化非酶小分子GSH[20]。本研究結果顯示，PD大鼠黑質內GSH-PX、SOD 活性降低，而MDA 含量升高，這是由于脂質過氧化反應增強的結果；而Rg3組以及陽性藥物組SOD、GSH-PX 活性高于模型組，MDA 含量低于模型組，以上研究結果反映了PD 模型大鼠黑質內抗氧化應激系統功能的減弱，MDA 含量的升高則反映了黑質內氧自由基含量的增多及細胞正處于脂質過氧化的階段，而人參皂苷Rg3 可能是通過提高機體清除自由基的酶的活力而抑制過氧化反應的。

綜上所述，氧化應激參與了PD 的發病機制，Rg3 可以提高機體的抗氧化能力。隨著對氧化應激介導的PD 發病機制的深入研究，對PD 抗氧化應激的治療將得到更多的認識和發展，也為臨床治療和預防PD 提供新的實驗依據。