鴿新城疫rGX-mF株滅活疫苗的制備及免疫原性分析

涂 敏,趙 蕾,史愛華,沈 佳,習 碩,張建偉,彭 湃,王海良,章振華*,靳 換*

(1.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所, 北京 100097; 2.北京翎羽生物科技有限公司, 北京 101302;3.北京市獸藥飼料檢測中心,北京 102200。)

鴿Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus type Ⅰ,PPMV-Ⅰ),又稱鴿新城疫病毒,其引起的臨床癥狀與雞新城疫相似,常見腸炎、下痢和神經癥狀,尤以嗜神經速發型多見[1]。各年齡段鴿均易感染,發病率可達80%,死亡率可達50%以上。

新城疫在世界范圍內呈地方流行,因此世界各國對該疫病的發生和流行均高度重視[2]。雖然世界各國充分認識到了新城疫的危害,促進了新城疫疫苗的研發和開發,免疫預防策略得到高度重視,但是賽鴿、觀賞鴿和肉鴿等作為新城疫強毒的潛在來源則被忽視。正因為如此,鴿子作為媒介在短時間里把新城疫病毒傳播到世界各國,造成了大流行,此次流行主要歸咎于賽鴿。1981年到1984年,PPMV-Ⅰ通過賽鴿迅速傳遍整個歐洲[3,4]。美國第一例PPMV-Ⅰ是1984年在紐約分離得到的,隨后1990～1998年間,美國國家獸醫局先后在東海岸地區、加利福尼亞州和德克薩斯州等地,從鴿群中分離到PPMV-Ⅰ,分離到的這些毒株基本都屬于基因Ⅵb亞型。2001年到2009年間,Pchelkina等人對從俄羅斯分離得到的77株PPMV-Ⅰ進行測序分析,發現這些毒株都屬于基因Ⅵ型[5]。我國最早于1985年和1986年在深圳和珠海的進口鴿中分離到PPMV-Ⅰ,隨后我國多個省市出現鴿新城疫的報道。我國目前鴿群中主要流行的毒株為基因Ⅵb亞型,該基因型對鴿有明顯的宿主特異性,在系統進化樹上形成了一個獨立的分支[6-7]。到目前為止,除了主要的新城疫基因Ⅶ型流行株外,其他基因型的毒株依然存在[8,9]。尤其是對鴿有明顯宿主特異性的Ⅵ型毒株,由于疫苗和其他生物制品的缺失,以及隨著我國養鴿業的迅速發展和在發展過程中凸顯出來的不平衡因素導致鴿新城疫給養鴿業造成了不可估量的經濟損失。

到目前為止,疫苗的免疫接種是防治新城疫最有效的手段,其不僅可以減輕發病和死亡的經濟損失,而且還可以降低強毒感染后的排毒量。目前常規的新城疫疫苗主要是弱毒疫苗和滅活疫苗,包括Ⅰ系疫苗(Mukteswar株)[10]、Ⅱ系疫苗(Hitchner B1)[11,12]、Ⅲ系疫苗(F株)[13]、Ⅳ系疫苗(Lasota株與Clone30株)[14,15]和V4疫苗株[16],由于市場上的這些疫苗主要是為防控雞新城疫而開發的,雖然在實際應用中能為鴿提供一定的免疫保護,但是效果不佳,經常出現免疫過的鴿場散發鴿新城疫的現象。其主要原因是由于疫苗毒株與流行毒株之間存在抗原差異。PPMV-Ⅰ為基因Ⅵ型,在系統進化樹上形成了一個獨立的分支[17,18],而疫苗株主要屬于基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等基因型,其與基因Ⅵ型的鴿新城疫病病毒遺傳關系較遠,存在明顯的抗原差異性;另外,交叉血凝抑制試驗和交叉中和實驗表明PPMV-Ⅰ與常用的疫苗Lasota株和強毒株之間存在顯著的抗原差異[19],表明了基因Ⅵ型的鴿新城疫病毒抗原發生了變異。用于疫苗免疫的毒株與流行毒株基因型越接近,則保護效果越好,群體帶毒和排毒量越低[20]。因此,研發與目前流行毒株匹配的基因Ⅵ型新城疫疫苗將有利于我國鴿新城疫的防控,對保障鴿養殖業的健康發展具有重要的意義。本研究利用基因Ⅵ新城疫致弱毒株rGX-mF制備滅活疫苗,評價該疫苗的免疫效果,為鴿新城疫的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 鴿新城疫病毒弱毒rGX-mF 株和雞新城疫病毒弱毒株La Sota株均為本實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 10日齡SPF雞胚,3周齡和6周齡SPF雛雞購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司;1日齡雛雞:SPF種蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司,在本實驗室孵化出雛;1月齡～2月齡鴿新城疫病毒抗體陰性鴿,購自某鴿廠。

1.2 方法

1.2.1 種毒的傳代增殖及無菌檢驗 將rGX-mF 株第一代種毒E1原液用滅菌生理鹽水按照1∶10000 倍進行稀釋,經尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚,0.1 mL/胚。接種后24 h內死胚棄去,收獲24 h～120 h死胚及120 h活胚,測定HA效價,收獲HA效價為210以上的尿囊液,-80 ℃保存備用。按此方法將種毒連續傳6代,命名為E1～E6。每代次毒種測定HA效價、雞胚半數感染量(EID50)以及進行無菌檢驗。

1.2.2 種毒的遺傳穩定性 參考引物F:5’-GTCAGTTTACCTGCCTAT-3’,R:5’-CTCCGACCGTTCTAC-3’,擴增插入的La Sota F基因序列。提取E1～E6各代次種毒的病毒基因組RNA,利用隨機引物對RNA進行反轉錄,隨后進行PCR擴增試驗,對擴增得到的目的片段進行測序鑒定。

1.2.3 種毒毒力的測定 根據世界動物衛生組織(WOAH) 推薦的判定標準,通過測定種毒的雞胚最小致死量的平均死亡時間(MDT)、1日齡雛雞腦內接種致病指數(ICPI)以及6周齡雞靜脈接種致病指數(IVPI)來判定rGX-mF種毒毒力的強弱。

1.2.4 滅活疫苗的制備 rGX-mF株毒種用滅菌生理鹽水稀釋按照1:10000倍,接種10日齡SPF雞胚,每胚接0.1 mL,置37 ℃繼續孵育。將接種后24 h內死胚棄去,24 h～120 h死胚及120 h活胚及時收取尿囊液,將HA效價為29及以上的樣品混合。測定混合后樣本的HA效價為210,病毒滴度為109.3EID50/0.1 mL。將測定好效價的病毒液導入滅活瓶內,加入終濃度為0.1%的甲醛溶液使其充分混合,置搖床160轉/min,37 ℃滅活24 h。滅活后的病毒原液按常規方法制備油佐劑滅活疫苗。用同樣的方法制備La Sota株滅活疫苗。

1.2.5 滅活疫苗的安全性試驗 將制備的rGX-mF株滅活疫苗免疫1～2月齡非免疫鴿10只,每只肌肉注射疫苗0.4 mL,同時設對照5只,在相同的條件下飼養,連續觀察14日,記錄試驗鴿采食、飲水及精神狀態。觀察疫苗接種后局部和全身不良反應情況。

1.2.6 抗體產生時間及免疫持續期 將15只鴿新城疫抗體陰性的雛鴿分為2組,免疫組10 只,對照組5只。將rGX-mF株滅活疫苗經胸部肌肉注射免疫,0.2 mL/只,分別于免疫后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、20、24、28、32、36、40、44、48和52周對兩組鴿子進行翅靜脈采血分離血清,檢測抗體水平,結果以 log2 表示,確定免疫后抗體產生的規律及持續期。

1.2.7 rGX-mF株與La Sota株滅活疫苗免疫原性的對比試驗 將20只1～2月齡鴿新城疫抗體陰性的雛鴿隨機分為2組,rGX-mF株組和La Sota株組,每組10 只。將rGX-mF株滅活疫苗和La Sota株滅活疫苗分別經胸部肌肉注射免疫,0.2 mL/只,分別于免疫后第21和28天對兩組鴿子進行翅靜脈采血分離血清,檢測抗體水平,結果以 log2 表示,對比分析兩種疫苗產生抗體的差異。

亞急性甲狀腺炎是一種常見于的內分泌腺病變，直接原因為病毒感染，其發病率和人們的生活方式和環境密切相關，主要是由綜合因素引起的炎癥反應，常見的因素包括環境因素、內分泌因素、消化系統因素和精神因素等。臨床發生亞急性甲狀腺炎的原因通常為內外相互作用的結果，所以亞急性甲狀腺炎的發病機制較為復雜[1]。亞急性甲狀腺在診斷上存在一定的難度，為了提高診斷的準確率，減少對亞急性甲狀腺炎診斷的漏診和誤診率，必須提高診斷的準確率。臨床研究發現[1]，本文將選取我院2016年5月—2017年5月收治的60例亞急性甲狀腺炎診斷患者的臨床資料進行回顧性分析，現報告如下。

1.2.8 rGX-mF株滅活疫苗對不同宿主免疫原性的對比試驗 分別取10只3周齡SPF雞作為雞免疫組,取10只1～2月齡鴿新城疫抗體陰性的雛鴿作為鴿免疫組。將rGX-mF株滅活疫苗經胸部肌肉注射免疫,0.2 mL/只,分別注射雞免疫組和鴿免疫組,于免疫后第7,14,21和28天對兩組實驗動物進行翅靜脈采血分離血清,檢測抗體水平,結果以 log2 表示,對比分析 rGX-mF株滅活疫苗在不同宿主中產生抗體水平的差異。

2 結果與分析

2.1 種毒的傳代增殖及無菌檢驗 rGX-mF株毒種經SPF雞胚連續傳代后,各個代次種毒的HA效價在1:1024～1:2048之間,毒價均在108.7EID50/0.1 mL以上,無菌檢驗合格,結果見表1。以上結果表明rGX-mF株病毒能在SPF雞胚中維持較高且穩定的毒價。

表1 rGX-mF株E1～E6代毒種無菌、支原體檢驗及病毒含量測定結果Tab 1 The sterility test, mycoplasma test and virus titer of E1～E6 generation viruses of rGX-mF strain

2.2 種毒的遺傳穩定性 將E1～E6代種毒的F基因進行測序,對序列進行比對分析,結果見圖1。結果表明,F基因序列中的核苷酸未發生任何突變或缺失,rGX-mF株種毒能夠在SPF雞胚中連續穩定的傳代。

圖1 rGX-mF 株E1-E6代F基因核苷酸序列比對Fig 1 Comparison of the nucleotide sequence of the F gene in the rGX-mF strain E1-E6

2.3 種毒毒力的測定 用于評價新城疫毒力的方法有MDT、ICPI及 IVPI。取1日齡SPF雛雞10只,雞只經腦內接種rGX-mF株 E5代種毒后,觀察的8天,10只雛雞全部正常,計算ICPI為0,結果見表2。

表2 rGX-mF株對1日齡SPF雛雞的腦內致病指數(ICPI)Tab 2 Intracerebral pathogenicity index (ICPI) of rGX-mF strain in 1-day-old SPF chicks

用滅菌生理鹽水將收獲新鮮的含毒尿囊液做10倍系列稀釋從10-1至10-9共9個稀釋度,分別接種10日齡SPF雞胚,上午8點每個稀釋度接種5個雞胚,每胚尿囊腔內注射0.1 mL,標記為A組。接種后剩余的病毒稀釋液放4 ℃保存,下午5點每個稀釋度分別再接種剩余的5個雞胚,標記為B組。接種后,每天分別于上午8點和下午5點,對A組和B組雞胚分別各照蛋一次,記錄每一雞胚的死亡時間,并測定每胚HA效價, 7天后,將所有活胚冷卻,測定每胚HA效價。A組和B組接種的雞胚全部死亡的最高稀釋度即為最小致死量,計算最小致死量的平均死亡時間。結果表明,120 h以內每個稀釋度的雞胚均沒有全部死亡,因此判定結果為MDT≥120 h,結果見表3A和表3B。

表3 A rGX-mF株對雞胚最小致死量的平均死亡時間(MDT/MLD)Tab 3 A The mean time to death (MDT/MLD) of minimum lethal dose of rGX-mF strain on chicken embryos

取6周齡SPF雛雞10只,用1 mL一次性注射器各靜脈注射10-1稀釋的新鮮rGX-mF株 E5代毒種0.1 mL。另取5只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.1 mL。接種后,每天在相應接種的時間觀察、記錄雛雞情況,包括正常、發病、癱瘓或出現其他神經癥狀和死亡。觀察10天,計算分數,正常為0,發病為1,癱瘓或出現神經癥狀為2,死亡為3。IVPI是指每只雞10天內所有每次觀察數值的平均值,計算IVPI=0,結果見表4。

表4 rGX-mF株對6周齡SPF雛雞的靜脈致病指數(IVPI)Tab 4 Intravenous pathogenicity index (IVPI) of rGX-mF strain in 6-weeks-old SPF chicks

2.4 滅活疫苗的制備 按常規方法制備rGX-mF株油佐劑滅活疫苗,油水比為2∶1。經檢驗,rGX-mF株滅活疫苗性狀如下:為乳白色均勻乳劑;W/O型,將疫苗滴入水中除第一滴外,均呈滴狀不擴散;黏度為74.10 cP;穩定性,吸取10 mL疫苗,3500轉/min,離心15 min,管底無水相析出;無菌檢驗合格。

2.5 滅活疫苗的安全性試驗 與對照組鴿相比,免疫組鴿采食和飲水正常,精神狀態良好,注射部位疫苗吸收良好、無結塊和腫脹等炎性反應,注射疫苗未對雛鴿產生不良影響。

2.6 抗體產生時間及免疫持續期 免疫后第1～52周采集免疫組和對照組鴿翅靜脈血,分離血清,進行血凝抑制試驗,檢測血清中抗體水平,確定免疫后抗體產生的規律及持續期。結果顯示,免疫組在免疫后至52周監測期結束均可產生一定效價的抗體,對照組無抗體(圖3)。rGX-mF株滅活疫苗免疫組在免疫后第7、8周免疫鴿的抗體水平達到最高,HI抗體滴度幾何平均值為8.8 log2,且其在免疫后第52周還可以產生較高的抗體水平,HI抗體滴度幾何平均值為5.6 log2(圖2)。

圖2 rGX-mF株滅活疫苗抗體的產生期和持續期Fig 2 The antibody production and duration of rGX-mF inactivated vaccine

圖3 rGX-mF株La Sota株滅活疫苗免疫鴿產生抗體的差異Fig 3 Difference of antibody production in pigeons immunized with rGX-mF strain and La Sota strain Inactivated vaccine

2.7 rGX-mF株滅活疫苗與La Sota株滅活疫苗的對比試驗 測定rGX-mF株疫苗免疫組和La Sota株疫苗免疫組血清中的抗體水平,對比分析兩種疫苗產生抗體的差異。結果顯示,兩組免疫組免疫21和28天后均可產生一定效價的抗體,rGX-mF株滅活疫苗免疫組的抗體效價明顯高于La Sota株滅活疫苗免疫組,并且差異顯著(圖3)。

2.8 rGX-mF株滅活疫苗對不同宿主免疫原性的對比試驗

檢測rGX-mF株滅活疫苗在雞免疫組和鴿免疫組血清中的抗體水平,對比分析rGX-mF株滅活疫苗在不同宿主中產生抗體水平的差異。結果顯示免疫后7,14,21和28天,SPF雞產生的抗體水平顯著高于鴿(圖4)。

圖4 rGX-mF 株滅活疫苗免疫鴿和雞產生抗體的差異Fig 4 Difference of antibody production between pigeons and chickens immunized with rGX-mF strain Inactivated vaccine

3 討 論

基因Ⅵ型鴿新城疫病毒在世界范圍內的鴿群中廣泛流行,給養鴿業造成了嚴重的經濟損失。我國目前對鴿新城疫的防控主要是以疫苗免疫為主,但是用于鴿免疫的疫苗株都是雞源新城疫疫苗,對鴿不能產生有效的免疫保護。研發與目前流行毒株基因型一致的鴿新城疫疫苗,可以有效的控制鴿新城疫的病程,為鴿群提供良好的免疫保護,降低鴿新城疫的防控成本。基因Ⅵ型鴿新城疫病毒有明顯的宿主特異性,主要感染鴿[23,24]。因此,本研究利用基因Ⅵ型鴿新城疫病毒弱毒株rGX-mF制備滅活疫苗,評估其免疫原性,為鴿新城疫滅活疫苗的研發奠定基礎。

WOAH規定禁止使用新城疫病毒強毒株制備新城疫疫苗,本研究首先測定rGX-mF株的毒力,結果顯示rGX-mF株的MDT大于120 h,ICPI=0, IVPI=0。依據WOAH的判定標準,rGX-mF株為弱毒株。將rGX-mF株在SPF雞胚上連續傳代,各個代次種毒的HA效價在1:1024～1:2048之間,毒價均在108.7EID50/0.1 mL以上。將各個代次病毒的F基因進行測序,結果顯示F基因序列中的核苷酸未發生任何突變或缺失,表明rGX-mF株在SPF雞胚中具有穩定的遺傳能力。以上研究結果表明,rGX-mF株具有毒力弱,繁殖能力高和遺傳穩定性好的特點。

本研究將rGX-mF株制備成油佐劑滅活疫苗,對該疫苗的免疫原性進行評價。使用制備合格的rGX-mF滅活疫苗,免疫1～2月齡雛鴿,免疫后鴿采食和飲水正常,精神狀態良好,注射部位疫苗吸收良好、無結塊和腫脹等炎性反應,表明疫苗注射未對雛鴿產生不良影響,無其他副作用。隨后對疫苗免疫后的抗體產生規律和水平進行了研究,發現免疫后第2周開始產生抗體,抗體滴度為4.8 log2,第4周抗體滴度達到7.4 log2,第7、8周抗體水平達到高峰,平均值為8.8 log2,且其在免疫后第52周還可以產生較高水平的抗體,平均滴度為5.6 log2。表明制備的油佐劑疫苗能在短時間內產生較高滴度的抗體,并且抗體滴度在5.6l og2以上至少可以維持 12個月。參考葉賀佳[25]等制定的標準,本研究制備的rGX-mF株滅活疫苗免疫鴿后可以產生良好的免疫效果。

與雞新城疫滅活疫苗(La Sota株) 進行對比,發現rGX-mF株滅活疫苗在鴿體內能夠產生更高水平的抗體。張俊平[26]等研究表明在免疫保護實驗中鴿新城疫疫苗的保護效果明顯優于雞新城疫疫苗,表明本研究制備的rGX-mF株滅活疫苗更適宜于鴿群中流行的基因Ⅵ型鴿新城疫病毒的防控。另外,本研究還對比了rGX-mF株滅活疫苗在不同靶動物體內產生抗體水平的差異,結果表明雞體內的抗體水平顯著高于鴿體內的抗體水平,這可能與雞和鴿的免疫系統差異有關。

綜上所述,rGX-mF株具有毒力弱,繁殖能力高,遺傳穩定性和免疫原性好的特點,可以作為鴿新城疫疫苗候選株,為臨床中鴿新城疫的防控提供保障。