超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛可食性組織中氟佐隆殘留

王亦琳,葉 妮,尹 暉,陳超超,王鶴佳,孫 雷

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

氟佐隆(Fluazuron, 化學(xué)式C20H10Cl2F5N3O3,CAS:86811-58-7)又稱啶蜱脲,氟啶蜱脲或吡蟲隆,屬于苯甲酰脲衍生物,是一種昆蟲發(fā)育抑制劑[1]。其在水中的溶解度小于0.02 mg/L,是一種親脂性物質(zhì)[2],化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。氟佐隆曾經(jīng)作為農(nóng)藥殺蟲劑廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜等種植行業(yè)[3-4]。在畜牧業(yè),氟佐隆是一種新型的抗寄生蟲藥[5-6],主要用于反芻動物,作為蜱、螨、壁虱等外寄生蟲的殺蟲藥。氟佐隆的作用原理是能抑制組成昆蟲表皮的主要成份幾丁質(zhì)的合成,通過抑制昆蟲蛻皮和新表皮的形成,延緩其發(fā)育;或使昆蟲表皮缺乏硬度,導(dǎo)致幼蟲死亡或形成畸形蛹而死亡[7]。研究發(fā)現(xiàn)通過皮下注射單劑量給與奶牛氟佐隆后,氟佐隆在脂肪中的分布遠(yuǎn)高于肌肉、腎臟和肝臟[8-9]。氟佐隆在牛體內(nèi)代謝較少,組織和糞便中的未代謝的原型藥物占總殘留量的90%[7]。氟佐隆主要的消除途徑是經(jīng)糞便排泄,其次是通過腎臟排泄,還有少量通過膽汁排泄。為防止在畜牧生產(chǎn)中濫用氟佐隆,造成相關(guān)動物性食品中氟佐隆的殘留,危害人類健康,我國2019年發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)[10]中規(guī)定了氟佐隆的最大殘留限量(MRL):在牛肌肉中為200 μg/kg,在牛脂肪中為7000 μg/kg,在牛肝臟和牛腎臟中均為500 μg/kg。

圖1 氟佐隆化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of fluazuron

目前國內(nèi)外已經(jīng)報道的氟佐隆的檢測分析方法主要有氣相色譜法[11],液相色譜法[12-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17],但這些方法有的樣品前處理過程比較繁瑣,有的方法靈敏度不高,還有的分析基質(zhì)為蔬菜等植物性食品,不能滿足動物可食性組織中氟佐隆殘留檢測的實(shí)際需求。本文建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法操作步驟簡單,靈敏度高,重復(fù)性好,可以滿足牛可食性組織中氟佐隆殘留檢測的要求,將對保障動物性食品安全,保證我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康地發(fā)展發(fā)揮積極的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A超高效液相色譜儀-美國AB SCIEX公司QTrap 6500質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源); AE260電子天平,Mettler Toledo公司; Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī),賀利氏公司; SIR4渦旋混合器,IKA公司;固相萃取裝置,Waters公司。

1.2 藥品和試劑 氟佐隆對照品(C20H10Cl2F5N3O3,CAS:86811-58-7),品牌Bepure,購自北京振翔科技有限公司,含量99.5%。甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),美國Fisher公司;Captiva EMR-Lipid固相萃取柱:300 mg/3 mL,美國Agilent公司;所用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取氟佐隆對照品約10 mg,置于10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取1 mg/mL的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋成濃度為10 μg/mL的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取 稱取試料各2±0.02 g于50 mL離心管中,加90%乙腈水溶液10 mL,加入一個陶瓷均質(zhì)子,渦旋1 min,8000 r/ min離心5 min,得上清液備用。

1.4.2 樣品的凈化 取3 mL備用液過captiva EMR-Lipid小柱,擠干,收集流出液,過0.22 μm尼龍微孔濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,粒徑1.7 μm),流動相A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫:0～0.2 min保持30% B;0.2～3 min,30% B線性變化到95% B;3～4 min 保持95% B;4～4.1 min 95% B線性變化到30% B;4.1～5.5 min 保持30% B。流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+);電噴霧電壓為5500V;離子源溫度為500 ℃;輔助氣1為55 psi;輔助氣2為55 psi;氣簾氣為30 psi;碰撞氣為Medium;檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。氟佐隆定性、定量離子對及對應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量見表1。

表1 氟佐隆MRM參數(shù)Tab 1 Mass parameters of fluazuron

1.6 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)工作液適量,用空白試料經(jīng)1.4提取凈化后的流出液稀釋成含藥物濃度分別為1、2、5、10、40、80和100 ng/mL(相當(dāng)于5、10、25、50、200、400和500 μg/kg添加濃度,針對牛肌肉)以及1、2、10、50、100、200和500 ng/mL(相當(dāng)于5、10、50、250、500、1000和2500 μg/kg添加濃度,針對牛肝臟、腎臟和脂肪)的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液,過微孔濾膜后由低濃度到高濃度依次上機(jī)測定。以氟佐隆的特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo),氟佐隆基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.7 方法靈敏度確定 添加適量濃度的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)工作液于2 g空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中,經(jīng)前處理后測定,觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N) 和對應(yīng)藥物濃度,以 S/N>3(按PtP算)作為方法的檢測限,以 S/N>10作為方法的定量限。

1.8 方法準(zhǔn)確度及精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法,在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中添加定量限、MRL、2MRL三個濃度的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)工作液。在牛肌肉中的添加濃度為10、200、400 μg/kg;在牛肝臟和腎臟中的添加濃度為10、500、1000 μg/kg;在牛脂肪中的藥物濃度為10、7000、14000 μg/kg。(由于牛脂肪的后兩個添加濃度較高,為了保護(hù)質(zhì)譜儀,避免樣品過載污染儀器和后續(xù)樣品,對MRL和2MRL這兩個添加濃度點(diǎn)的脂肪樣品進(jìn)行稀釋處理:樣品按1.4項前處理后,將收集的流出液用空白脂肪樣品經(jīng)前處理得到的流出液稀釋10倍后過濾,上機(jī)測定)每種濃度5個樣品平行試驗(yàn),重復(fù)3次,按照1.4項樣品前處理方法處理之后上機(jī)測定,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量,計算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.9 基質(zhì)效應(yīng)的考察 取空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪樣品,按1.4項進(jìn)行樣品前處理,用空白樣品流出液配制成氟佐隆濃度為:牛肌肉2、40、80 ng/mL,牛肝臟和腎臟2、100、200 ng/mL,牛脂肪2、140、280 ng/mL的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個濃度6份。用初始流動相配制成氟佐隆濃度分別與上述濃度相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液,作為基質(zhì)效應(yīng)考察的參照溶液。對上述樣品進(jìn)樣分析,記錄氟佐隆的峰面積并計算基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)計算公式:基質(zhì)效應(yīng)%=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積/參照溶液的峰面積×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 以氟佐隆的特征離子質(zhì)量色譜峰面積與其對應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖,得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程及決定系數(shù)(R2)見表2。氟佐隆在牛肌肉1～100 ng/mL的的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi);在牛肝臟、腎臟和脂肪1～500 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi),特征離子質(zhì)量色譜峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系,R2均>0.990。

表2 氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和決定系數(shù)Tab 2 Regression equations and coefficient of determination of fluazuron

2.2 方法靈敏度 按1.7項中所述方法進(jìn)行處理,依據(jù)氟佐隆特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>3和S/N>10分別為方法的檢測限和定量限,得出在空白牛肝臟、腎臟、肌肉和脂肪中,氟佐隆的檢測限均為5 μg/kg,定量限均為10 μg/kg,特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

1. 牛肌肉;2. 牛肝臟;3. 牛腎臟;4. 牛脂肪1. Cattle muscle;2. Cattle liver;3. Cattle kidney;4. Cattle fat圖2 10 μg/kg空白牛可食性組織添加樣品中氟佐隆藥物特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 2 Characteristic ion mass chromatogram of fluazuron 10 μg/kg added in blank cattle edible tissues

2.3 方法準(zhǔn)確度及精密度 在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中各添加3個不同濃度的氟佐隆標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果匯總見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明,氟佐隆在牛肌肉10～400 μg/kg、牛肝臟和牛腎臟10～1000 μg/kg、牛脂肪10～14000 μg/kg空白添加濃度范圍內(nèi)的回收率為72.0%～98.6%;批內(nèi)與批間RSD均小于15%。結(jié)果表明本方法定量準(zhǔn)確,重復(fù)性好。

表3 空白牛可食性組織中氟佐隆添加的回收率(n=5)Tab 3 Recoveries of fluazuron in blank cattle edible tissues

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果 按1.9項所述方法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察,結(jié)果匯總見表4。從考察結(jié)果可以看出本分析方法的基質(zhì)效應(yīng)較微弱,但考慮到實(shí)際樣品檢測時可能會處理來源較為復(fù)雜的樣品,基質(zhì)效應(yīng)可能會有變化。因此,在定量方法選擇時仍然采用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法進(jìn)行定量,消除可能存在的基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響,提高定量的準(zhǔn)確性。

3 討論與小結(jié)

3.1 提取方法的選擇 由于氟佐隆不溶于水,目前已報道的文獻(xiàn)中多采用純乙腈[3,13]或正己烷[15]等有機(jī)溶劑作為氟佐隆的提取溶劑。考慮到乙腈和正己烷等有機(jī)溶劑具有一定的毒性,且本方法的分析樣品為牛肉等生物樣品,在加入純有機(jī)溶劑渦旋提取時樣品容易成團(tuán),影響提取效率。經(jīng)過比較,選用了5倍稱樣體積的90%乙腈水溶液作為提取溶劑,渦旋提取一次,能有效提取樣品中的氟佐隆藥物殘留。為防止加入提取液之后樣品結(jié)塊,本方法在每個樣品管中加入一個帶有切面的陶瓷勻質(zhì)子,在渦旋提取操作時可以有效防止樣品結(jié)塊成團(tuán),提高了提取效率。

3.2 凈化方法的選擇 在關(guān)于動物可食性組織中氟佐隆殘留檢測的文獻(xiàn)中,有報道采用Florisil 固相萃取小柱[8]和中性氧化鋁小柱[15]凈化處理樣品。由于氟佐隆的酸度系數(shù)(pKa)為8.61±0.46,偏堿性,試驗(yàn)中曾選擇了Oasis MCX小柱和Bond Elut Plexa PCX小柱進(jìn)行凈化效果的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCX與PCX柱的樣品前處理過程操作復(fù)雜,處理樣品耗時較長,與文獻(xiàn)報道的凈化方法相比并無明顯優(yōu)勢。本試驗(yàn)最終選擇了EMR-Lipid柱進(jìn)行樣品的凈化。提取液經(jīng)高速離心后直接上樣于EMR-Lipid小柱,收集樣品流出液后直接過濾膜上機(jī)測定。整個凈化步驟相比文獻(xiàn)報道的凈化方法操作簡單,無需將固相萃取小柱預(yù)先活化,也省略了氮?dú)獯蹈蓸悠泛蜆悠窂?fù)溶等步驟。從得到的譜圖和回收率數(shù)據(jù)中可以看出,該方法在有效去除基質(zhì)干擾的同時,樣品回收率較高,可以滿足氟佐隆殘留檢測的要求。

3.3 濾膜材質(zhì)的考察 試驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)使用PTFE材質(zhì)的濾膜,藥物吸附嚴(yán)重,可以使藥物響應(yīng)值下降約2個數(shù)量級。通過比較PTFE、PES、GHP和尼龍等多種材質(zhì)的濾膜,最終確定了尼龍材質(zhì)的濾膜基本無藥物吸附,最終選擇0.22 μm的尼龍膜過濾樣品。

目前國內(nèi)外尚未檢索到檢測牛可食性組織中氟佐隆殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,本方法的建立填補(bǔ)了國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的空白。該方法快速、便捷,具有良好的可操作性和重現(xiàn)性,方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求,具有良好的應(yīng)用前景。