銅代謝失調與細胞損傷及肝病的關系

柳濤， 劉雅麗， 張飛宇， 高沿航

吉林大學第一醫院肝膽胰內科， 長春 130021

銅是人體必需的微量元素，為人體許多代謝關鍵酶的重要組成成分，如：Cu/Zn超氧化物歧化酶1（copper/zinc superoxide dismutase，SOD1）、細胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，CCO）、賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），人體在細胞和分子水平上的銅代謝過程見圖1。因具有兩種離子狀態，所以其在機體氧化還原反應中是重要的輔助因子。2022年3月研究人員新發現一種銅依賴性細胞死亡方式：銅死亡（cuprotosis）［1］，該發現進一步強調人體對銅穩態機制的需求。人體銅水平處于動態平衡，無論遺傳性還是獲得性銅穩態失調均會導致或加重某些疾病，如Menkes病、Wilson病（Wilson’s disease，WD）、癌癥等。近年來隨著研究的不斷深入，研究人員發現銅穩態失衡會通過多種途徑促進細胞損傷并與多種肝臟疾病的發生、發展密切相關［2-3］。本文總結近年來有關研究結果，為未來肝臟疾病診療提供新思路。

圖1 肝細胞的銅穩態機制Figure 1 Mechanism of copper homeostasis in hepatocytes

1 銅穩態失衡促進細胞損傷機制

1.1 銅和氧化應激

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是人體細胞代謝副產物，高濃度的ROS可引起細胞結構與功能損傷、增加細胞癌變的風險、誘導細胞死亡的發生［4］。生理狀態下胞內銅處于一種動態平衡，銅水平過高或過低均可使細胞發生氧化應激。

1.1.1 細胞內銅超負荷導致氧化應激發生 銅超負荷時可通過Fenton反應產生大量ROS，降低胞內還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，導致細胞對有害刺激敏感性升高。有研究［5］表明胞內銅超負荷通過誘發氧化應激，導致線粒體膜通透性改變、DNA損傷、促凋亡蛋白表達增加［如B細胞淋巴瘤-2基因的相關X蛋白（B cell lymphoma -2 associated X protein，BAX）、半胱天冬酶-3、9］，進而誘發細胞凋亡的發生。

1.1.2 細胞內銅缺乏導致氧化應激發生 人體存在多種銅依賴性抗氧化酶（如：SOD1、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶），銅缺乏導致上述銅酶活性降低，胞內ROS蓄積誘導氧化應激的發生。SOD1突變是肌萎縮性側索硬化癥的重要遺傳病因，研究證實神經元細胞內銅缺乏通過增加突變的SOD1錯誤折疊和改變其疏水性導致神經細胞損傷和死亡的發生，而口服銅絡合物可明顯減少小鼠脊髓內的運動神經元死亡數量［6］。

1.2 銅與蛋白酶體 研究表明腫瘤細胞內蛋白酶體活性明顯增加，通過降解細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（如P21和P27）、腫瘤抑制因子（如P53）、細胞凋亡抑制因子和細胞凋亡調節因子（如BAX）等促進腫瘤生長。2020年Ga?czyńska等［7］研究證實蛋白酶體抑制劑通過促進細胞色素C進入細胞質基質，結合并激活凋亡蛋白酶激活因子1和前體半胱天冬酶-9，導致細胞凋亡的發生。而胞內銅超負荷可通過誘導氧化應激介導26S蛋白酶體的分解進而抑制胞內蛋白酶體活性［8］。

1.3 銅死亡

2022年Tsvetkov等［1］在人類細胞中發現一種不同于已知的細胞死亡方式：銅死亡，這是一種由線粒體銅的靶向積累引發的新形式的細胞死亡，下文將從三個方面簡述銅死亡發生機制。

1.3.1 銅代謝紊亂 銅離子載體可以打破人體細胞內銅的動態平衡［1］，用銅離子載體（如：伊利司莫）處理后胞內銅水平升高，過多的銅與脂酰化蛋白的硫辛基部分結合誘發脂酰化蛋白聚集，導致細胞銅死亡的發生，而銅螯合劑、鐵氧還蛋白1（銅離子載體伊利司莫作用靶點）［9］和硫辛基合成酶基因敲除可以降低細胞發生銅死亡的風險。

1.3.2 三羧酸循環脂酰蛋白功能紊亂 脂酰化蛋白聚集是銅死亡發生的關鍵，已知蛋白脂酰化僅發生在三羧酸循環中的四種關鍵酶，丙酮酸脫氫酶復合體的E2亞基二氫硫辛酸轉乙酰化酶（dihydrolipoamide transacetylas，DLAT）正是其中之一。銅超負荷引起DLAT的聚集、Fe-S簇蛋白水平降低、熱休克蛋白70數量增加、蛋白質毒性應激，從而導致銅死亡的發生。

1.3.3 線粒體有氧呼吸調節銅死亡 線粒體有氧呼吸在銅死亡的發生中起重要調節作用［1］，實驗證實在缺氧條件下（1% O2）生長的細胞不易發生銅死亡。使用低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）分解關鍵酶脯氨酸羥化酶抑制劑處理常氧條件下（21% O2）生長的細胞，其銅死亡發生率未見明顯改變。Tsvetkov等［1］也通過抑制細胞線粒體呼吸證實線粒體有氧呼吸在銅死亡中發揮重要調節作用。

1.4 銅與血管形成 人體血管生成是血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、IL-1、IL-6、IL-8等多種小分子綜合作用的結果［10］。有研究［11］表明，銅可通過與血管生成素直接結合或結合HIF-1后激活上述小分子進而刺激血管生成。此外銅還可通過促進血管內皮增殖及遷移、細胞外基質降解以促進血管生成，胞內銅降低可抑制血管生成，切斷組織的營養供應，導致細胞發生損傷和死亡。

1.5 銅與細胞凋亡、自噬、鐵死亡 X連鎖細胞凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）可結合并抑制半胱天冬酶3、7和9的活性進而調節細胞凋亡的發生［12］。XIAP具有很強的銅親和力，與銅可逆性結合后極易發生泛素化蛋白酶體降解同時喪失抑制細胞凋亡能力，進而降低細胞凋亡的發生閾值。XIAP可通過介導銅代謝MURR1結構域1（copper metabolism MURR1 domain1，COMMD1）的泛素化蛋白酶體降解調節細胞銅水平，銅超負荷可降低胞內XIAP水平，導致COMMD1的水平升高，促進銅從細胞流出［13］。

研究發現胞內異常升高的銅可激活自噬相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶Unc51樣自噬激活激酶1和2（unc-51 like autophagy activating kinase 1、2，ULK1、2）依賴性信號轉導通路誘導細胞發生自噬。Yang等［14］研究發現胞內銅超負荷可促進胞內自噬相關基因的轉錄和翻譯，從而抑制銅誘導細胞凋亡的發生。有研究證實ATP7B敲除細胞內自噬相關基因表達水平明顯上調［15］，Polishchuk等［16］同樣發現在WD患者及ATP7B缺乏小鼠肝細胞內過量的銅通過Cu-mTORC1-TFEB信號轉導提高胞內自噬水平，抑制自噬可明顯加速細胞凋亡的發生。

既往研究發現鐵死亡在雙硫侖-Cu的抗腫瘤作用中發揮關鍵作用，Gao等［17］用伊利司莫處理細胞使胞內線粒體銅水平升高，誘導氧化應激與鐵死亡的發生。有趣的是，Li等［18］研究證實細胞銅耗竭通過降低胞內GSH含量及抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性，也可促進細胞鐵死亡的發生，從而建立了銅耗竭與鐵死亡的直接聯系。除上述的直接聯系，Guo等［19］發現胞內銅超負荷通過ROS依賴性AMPK-mTOR途徑誘導自噬進而抑制細胞凋亡的發生，而自噬水平升高反過來通過抑制GPX4和降解FTH1等鐵蛋白促進細胞鐵死亡的發生。但也有研究［20-21］表明肝細胞癌（HCC）細胞內銅超負荷，一方面促進銅藍蛋白（ceruloplasmin，CP）合成降低胞內鐵水平，其次通過Cu-HIF1α-SLC7A11（GSH合成關鍵蛋白）途徑促進GSH合成，進而抑制胞內鐵死亡的發生。

線粒體損傷在WD發生發展中發揮重要作用，Zischka等［22］發現在WD早期，隨著肝銅水平升高引起線粒體漸進式結構損傷，而這早于氧化應激的發生。胞內銅水平升高及線粒體損傷均可誘導線粒體選擇性自噬的發生，以減少銅毒性及抑制線粒體介導的細胞凋亡發生。線粒體為銅死亡發生的核心，線粒體選擇性自噬極可能抑制銅死亡的發生，而自噬與銅死亡的關系仍需要進一步研究證實（圖2）。

圖2 銅缺乏或超載促進細胞損傷的機制示意圖Figure 2 Schematic illustration of the mechanism by which copper deficiency or overload promotes cell damage

2 銅穩態失衡與肝病的關系

2.1 銅與WD WD是一種常染色體隱性遺傳病，由銅轉運P型ATP酶（ATP7B）先天突變導致銅在肝臟及其他組織中累積［2］，進而引發一系列病變。

近年來研究發現WD患者過量肝銅通過抑制核受體功能、導致線粒體功能障礙等引發WD的肝臟病變。核受體參與調節細胞基因表達，WD患者異常升高的銅通過抑制核受體進而影響細胞脂質代謝。肝臟X受體（liver X receptor，LXR）是WD早期銅作用的主要靶點之一，Hamilton等［23］單獨使用LXR激動劑T0901317治療ATP7B缺陷小鼠，結果顯示肝纖維化和炎性細胞因子顯著降低，肝功能和組織學得到改善。以往觀點認為WD患者異常升高的肝銅主要通過誘發氧化應激導致線粒體功能障礙，但近年來研究發現在肝銅介導的氧化應激發生之前，線粒體銅較正常水平升高約200倍，引起線粒體內外膜交聯、線粒體膜電位變化、ATP產生減少和抑制線粒體DNA復制［22，24-25］，從而導致線粒體結構、功能障礙和細胞凋亡的發生。

更早診斷及開始銅螯合治療可以明顯改善WD患者預后及預防神經系統癥狀的發生，現有的診斷方法早期診斷WD比較困難，這就要求尋找新的診斷方法及生物標志物。近年來有研究發現血液相對可交換銅和ATP7B肽濃度在診斷WD中具有高敏感性和特異性，但實際應用需要進一步驗證。

口服銅螯合劑和鋅是WD患者一線治療方法，長期口服的不良反應、神經系統癥狀惡化仍是WD治療所面臨的挑戰，而肝細胞及線粒體導向銅螯合劑的研究有望改善這一困境。恢復ATP7B定位、功能的靶向分子療法及基因治療也在積極研發中［2，25］。銅可通過多種途徑促進腫瘤的發生發展，但有證據表明WD患者肝臟惡性腫瘤發病率遠低于其他病因［26-27］，研究人員推測這可能與WD患者長期口服銅螯合劑掩蓋了肝銅的“自然”分布相關［26］。但也有證據表明過量銅攝入可以抑制大鼠化學毒物誘導細胞癌變，而長期口服銅螯合劑導致肝鐵積聚和隨后對肝細胞的傷害，可能是長期口服銅螯合劑WD患者發生HCC的一個原因。總之，HCC是WD患者的一種罕見并發癥，闡述這種關聯有助于WD患者肝臟惡性腫瘤的早期診斷和管理。

2.2 銅與非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） NAFLD是一組以肝臟中脂肪堆積為特征的疾病，包括非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），最終可導致肝硬化和HCC，流行病學調查顯示全球NAFLD患病率約為25%，已成為最常見的慢性肝病［28］。有證據表明，銅穩態失衡與NAFLD的發病密切相關，既往研究［29］發現NAFLD動物模型的肝銅水平降低，同時成人和兒童NAFLD患者的血清、肝臟和頭發中的銅水平均較對照組降低。Tosco等［30］對銅缺乏大鼠的研究強調胞內銅水平降低通過損傷細胞線粒體形態和功能，抑制游離脂肪酸β氧化，促進肝細胞脂肪變性。果糖通過抑制十二指腸CTR-1表達減少銅的吸收，Song等［31］實驗發現高果糖飲食小鼠的血清銅及肝銅水平降低，而低銅會顯著抑制細胞脂肪酸β氧化限速酶肉堿棕櫚酰轉移酶及上調細胞脂肪酸合成關鍵酶脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）的表達，誘發小鼠肝臟脂肪變性及肝細胞損傷。

研究［32］表明，銅攝入不足可能與NAFLD有關。Tallino等［33］發現低銅和高蔗糖飲食會明顯上調與肝臟炎癥、纖維生成和FAS相關的基因轉錄和表達，在沒有嚴重肥胖的情況下，誘導肝臟脂肪變性和損傷的發生。肝銅降低通過抑制CP的活性和肝臟鐵轉運蛋白的表達減少肝鐵輸出，Aigner等［32］通過肝臟活檢顯示NAFLD患者的肝鐵含量增加，而鐵超負荷也通過誘導氧化應激、胰島素抵抗和肝臟炎癥來促進NAFLD發展，這些因素在NAFLD的發生和發展中起著關鍵作用。

與上述結果相矛盾的是，許多肝病的流行病學特征、疾病進展和治療策略存在性別相關差異［34］。最近的一項研究也表明，血銅水平與NAFLD之間的關系僅在男性患者中顯著［35］，這可能與雌性激素的保護作用及銅攝入量存在性別差異相關。St?ttermayer等［36］發現僅在無代謝綜合征的NAFLD患者中，肝銅水平和肝脂肪變性程度之間存在負相關，這一結果與Lan等［35］的發現相反，這種差異可能是作者在實驗中未考慮性別因素。此外，Aigner等［32］發現相比NAFL，NASH患者的肝銅含量更低，這表明肝銅水平與NAFL/NASH的進展相關。然而，也有證據表明NAFLD進展至肝硬化階段，肝銅水平明顯升高，具體原因尚未可知［37］。這些矛盾的結果提示銅與NAFLD之間具有更為復雜的聯系，在未來需要進一步研究闡述銅在NAFLD發生、發展中的作用。

2.3 銅與HCC HCC是肝臟最常見的惡性腫瘤，是世界腫瘤相關性死亡第四大原因［38］。有證據表明HCC患者血清及肝銅水平升高［39］，而這種現象可能與HCC細胞ATP7B下調或大型胞飲作用密切相關，同時Davis等［40］也發現敲除HCC細胞CTR-1基因可明顯抑制腫瘤細胞增殖和轉移。研究表明銅可通過多種機制促進腫瘤形成，具體機制尚未完全闡明，但研究人員使用銅處理HCC細胞顯示可增強其增殖和遷移能力。大多數HCC細胞MYC明顯過表達，2018年Porcu等［41］發現HepaRG細胞中過表達的MYC和MYC關聯因子X結合后，與CTR-1基因啟動子結合并誘導其轉錄，通過提高胞內銅水平促進腫瘤細胞增殖和遷移。

LOX家族是銅依賴性賴氨酰氧化酶，人HCC組織中LOX表達水平明顯升高，研究表明LOX家族通過TGF-β介導的P38MAPK-VEGF信號轉導促進血管形成，通過H1F-1/LOX信號轉導通路使得細胞外基質膠原蛋白相互交聯，促進HCC細胞生長與轉移［42］。同時HCC組織中LOXL-2水平與HCC患者總體生存期和疾病特異性生存期呈負相關［43］。四硫鉬酸鹽（tetrathiomolybdate，TTM）已被證明可通過影響LOX活性來抑制細胞增殖和頭頸部鱗狀細胞癌的骨破壞行為，但其在HCC中的應用未來仍需進一步研究［44］。

COMMD蛋白家族在銅代謝中起關鍵作用，COMMD1缺乏引起細胞ATP7B從胞質囊泡到胞質膜運輸缺陷，肝銅排出受阻導致肝內銅水平異常升高［45］。2022年Yang等［20］研究發現COMMOD10通過改變胞內Cu/Fe平衡和HIF-1/CP通路來影響HCC細胞放射抵抗性和鐵死亡的發生，因此銅螯合劑TEPA可作為HCC患者的潛在放療致敏劑。

HCC細胞中異常銅穩態為其診斷和治療提供了一個新的方向［40］，Yoshii等［46］研究發現曲恩汀（一種銅螯合劑）可通過抑制內皮細胞增殖和誘導細胞凋亡顯著抑制HCC的生長和血管生成。HCC細胞內因糖酵解增強導致乳酸含量上升，進而通過乳酸/NF-κB/IL-8軸促進腫瘤血管生成，而這也與經導管肝動脈栓塞術/肝動脈灌注化療栓塞術（transarterial embolization/transarterial chemoembolization，TAE/TACE）術后腫瘤快速復發相關。2020年Davis等［40］證實銅與HCC細胞在缺氧條件下代謝重編程密切相關，TTM螯合HCC胞內銅后可降低HCC糖酵解水平，進而抑制腫瘤細胞增殖活性，而TTM與TAE/TACE聯合治療HCC的療效也尚待進一步研究。肝臟負責吸收和代謝含有金屬的復合物，Rezaei等［47］發現Cu（Ⅱ）復合物通過上調HepG2細胞抑癌基因P53和凋亡基因（BAX和半胱天冬酶-8）的表達以及下調抗凋亡基因BCL-2的表達，誘導細胞發生凋亡，同時一些新型銅復合物也被開發用于HCC的光動力治療。

一項來自我國廣東的臨床研究［48］發現，HCC患者血清銅水平與肝癌特異性生存期和總體生存期顯著相關，這表明循環銅水平可能是HCC生存期的獨立預測因子。與原發性HCC相反，轉移HCC細胞銅攝取增加，因此64Cucl2-PET-CT可用于非侵入性評估位于生理銅攝取低區域的HCC的顱內轉移和其他肝外轉移，可用于肝移植患者術前評估，對改善轉移性HCC患者的預后具有重要意義。此外放射性銅同位素也可作為放射性藥物用于HCC肝外轉移的治療。

3 展望

最近的研究揭示了銅代謝的分子機制及其在人類疾病中的作用，銅死亡的發現為疾病機制的研究以及診斷和治療方式的改進提供了新的思路和期望，銅螯合劑和銅補充劑也已被廣泛用于銅代謝引起的疾病中。近年來銅代謝失調與肝臟疾病之間的關系已被充分證實，除了WD、NAFLD和HCC等肝臟疾病外，還有一些證據表明酒精攝入［49］和HCV感染［50］可能會影響人類的銅代謝調節，未來進一步探索銅代謝與慢性病毒性肝病和非病毒性肝病之間的關系，將為闡明這些疾病的發病機制和尋找新的治療目標提供理論證據。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：高沿航負責課題設計；高沿航和柳濤進行查閱文獻并起草論文；高沿航、柳濤、劉雅麗和張飛宇參與文章撰寫及修改，校閱論文。