不同廠家八寶驚風散中人工牛黃膽汁酸類活性成分的含量測定及差異分析Δ

鐘琪 ，陳偉康 ，周國平 ，劉艷梅 ，劉德鴻 #，李晶 （1.贛州市人民醫院藥劑科，江西 贛州 41000；.江西省藥品檢驗檢測研究院/國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室/江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 009；.江西省中醫藥研究院，南昌 009）

八寶驚風散質量標準收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第二十冊，由天麻（制）、黃芩、人工牛黃等19味中藥組成。該品種具有祛風化痰、退熱鎮驚之功效，可用于小兒驚風、發燒咳嗽、嘔吐痰涎，因其臨床療效較好，被譽為“兒科圣藥”。其中，人工牛黃在方中發揮清熱解毒、退熱、化痰定驚的重要作用。但八寶驚風散現行質量標準中僅有顯微鑒別、黃酮類化合物化學鑒別、丁香薄層鑒別項，無含量測定項；經查閱文獻，雖有一些關于方中藥味的質量研究報道，卻均未探討人工牛黃的質量控制標準。人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，可用于痰熱譫狂、神昏不語、小兒急驚風等病癥的治療[1]。膽酸、豬去氧膽酸、牛磺膽酸為人工牛黃中的主要活性成分[2]，具有非常好的抗菌[3]、抗病毒[4]作用，尤其對β-內酰胺酶耐藥菌株感染亦有較好的療效[5]，因此也是小兒氨酚黃那敏顆粒、小兒化毒膠囊、氨金黃敏顆粒、復方小兒退熱栓等小兒常用退熱藥品的重要組成成分。中國傳統醫學中的小兒驚風發熱與現代醫學中的細菌、病毒感染等密切相關。基于人工牛黃在抗菌、抗炎、抗病毒及退熱方面所起的重要作用，以及八寶驚風散現有質量控制方法中對人工牛黃質量控制的缺失，同時考慮到人工牛黃價格較高，市場上摻偽現象常見等諸多因素，對八寶驚風散中人工牛黃的3個活性膽汁酸類成分開展質量評價工作具有重要意義。

本研究擬采用超高效液相串聯質譜法，建立八寶驚風散中膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的含量測定方法，并對3個廠家的9批樣品進行差異分析，旨在為提高八寶驚風散中人工牛黃的質量控制標準及臨床療效提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、API型4000三重串聯四極桿質譜儀（美國AB Sciex公司）、ML204T型萬分之一天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、BT 25 S型十萬分之一天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

9批八寶驚風散均為市售品，分別來自屬地為廣東、江西的A、B、C 3個廠家，樣品編號分別為A1～A3、B1～B3、C1～C3；制備陰性樣品所用飲片均購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司。膽酸對照品（批號100078-201415，純度98.9%）、豬去氧膽酸對照品（批號100087-201411，純度99.7%）、牛磺膽酸鈉對照品（批號110815-201911，純度87.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜級，購自美國Sigma-Aldrich公司；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與質譜條件

以Phenomenex Luna?C18（150 mm×2 mm，3 μm）為色譜柱；以乙腈為流動相A、水為流動相B，進行梯度洗脫（0～4 min，5%A→40%A；4～7 min，40%A→70%A；7～10 min，70%A；10～10.1 min，70%A→5%A；10.1～14 min，5%A）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

采用電噴霧離子源，噴霧氣壓力為60 psi，干燥氣壓力為50 psi，氣簾氣壓力為25 psi；離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為-4 500 V；負離子單四極桿模式；膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的m/z分別為407.2、392.2、514.2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液

取膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉對照品各適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇分別制成質量濃度為109.68、107.68、94.81 μg/mL的對照品儲備液。分別精密量取各對照品儲備液0.2 mL，置同一100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得質量濃度分別為219.36、215.36、189.62 ng/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取八寶驚風散0.1 g，精密稱定，置具塞棕色錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5 mL，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液

按八寶驚風散的處方及工藝制備缺人工牛黃和膽南星的陰性樣品（因膽南星為天南星用膽汁炮制而成，其中含少量的膽汁酸類成分），按“2.2.2”項下方法制備成陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗

分別取陰性樣品溶液、混合對照品溶液和供試品溶液（編號A1），按“2.1”項下檢測條件進樣測定。結果顯示，陰性樣品溶液對檢測無干擾，色譜見圖1。

2.3.2 線性關系考察及檢測限、定量限測定

精密吸取“2.2.1”項下各對照品儲備液0.025、0.025、0.025、0.2、0.2、0.25 mL，分別置500、100、50、200、100、50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成膽酸質量濃度分別為5.48、27.42、58.84、109.68、219.36、548.40 ng/mL，豬去氧膽酸質量濃度分別為5.38、26.92、53.84、107.68、215.36、538.40 ng/mL，牛磺膽酸鈉質量濃度分別為4.74、23.70、47.40、94.81、189.62、474.05 ng/mL的混合對照品溶液，按“2.1”項下檢測條件進樣測定，以各成分質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，用Analyst工作站擬合標準曲線。精密吸取混合對照品溶液進行梯度稀釋，分別以信噪比為3∶1和10∶1時對應的質量濃度作為各成分的檢測限和定量限，結果見表1。

表1 待測成分的線性關系考察結果和檢測限、定量限結果

2.3.3 精密度試驗

取供試品溶液（編號A1），按“2.1”項下檢測條件連續進樣6次，測定峰面積，計算RSD。結果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉峰面積的RSD分別為2.1%、1.9%、2.2%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗

取供試品溶液（編號A1），按“2.1”項下檢測條件，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時分別進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。結果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉峰面積的RSD分別為2.9%、3.1%、3.5%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗

取八寶驚風散（編號A1）6份，每份0.1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，并按“2.1”項下檢測條件進樣分析，按外標法計算含量。結果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的平均含量分別為1.483、1.768、1.503 mg/g，RSD分別為2.5%、3.7%、3.2%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

精密稱取八寶驚風散（編號A1）6份，每份0.05 g，分別精密加入含膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉對照品的甲醇溶液（膽酸1 535.52 ng/mL、豬去氧膽酸1 722.82 ng/mL、牛磺膽酸鈉1 516.92 ng/mL）50 mL，按“2.2.2”項下自“稱定質量”起，同法制備成供試品溶液；再按“2.1”項下檢測條件進樣分析，記錄峰面積，并計算回收率及RSD。結果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的平均回收率分別為103.3%、103.3%、101.6%，RSD分別為3.3%、3.4%、4.2%（n＝6），表明方法準確度良好。

2.4 樣品含量測定

取不同批次八寶驚風散，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項下檢測條件進樣分析，按外標法計算各批次樣品中膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的含量，結果見表2。

2.5 樣品數據分析

對表2數據進行描述性及探索性分析，結果顯示，3個廠家樣品之間膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉含量存在一定差異，推測是由于投料的人工牛黃質量差異或者生產工藝不同導致的。A廠家樣品3個成分的平均含量均高于其他2個廠家樣品，且批間差異最小；C廠家樣品3個成分的平均含量均低于其他2個廠家樣品，且批間差異較大。這表明A廠家樣品中人工牛黃的質量和對生產工藝的控制能力可能優于其他2個廠家；C廠家樣品的質量相對較差，批間差異大，質量控制不穩定。應用IBM SPSS軟件，采用組間連接系統聚類法，以平方歐氏距離為測度進行聚類分析，結果見圖2。當歐氏距離為7.0時，9批樣品可聚為3類，A1～A3、C2為第1類，B1～B3為第2類，C1、C3為第3類，基本可以區分不同廠家的樣品；但C廠家有1批樣品與A廠家的3批樣品歸為一類，其可能原因為C廠家的人工牛黃原料批間差異較大或生產工藝批間差異較大。上述結果表明，不同批次樣品3個成分的含量存在一定的差異，這可能與廠家所用原料和生產工藝存在差異有關。

圖2 9批八寶驚風散聚類分析樹狀圖

以3個成分的含量為變量，對9批樣品進行主成分分析，以主成分的特征值及貢獻率作為選擇主成分的依據，結果，主成分1特征值為2.589，貢獻率為86.285%，是唯一主成分。計算3個廠家樣品的主成分綜合得分，A、B、C 3個廠家樣品的得分分別為2.36～2.63、1.77～2.04、1.09～2.43，RSD分別為6.2%、7.2%、47.3%。以主成分綜合得分為指標進行聚類分析，結果（圖略）與含量聚類分析結果基本一致。

3 討論

3.1 測定方法的選擇

膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉均為甾體類化合物，紫外吸收為末端吸收，使用常規的紫外檢測器難以取得理想效果[6]。也有學者采用蒸發光散射檢測器[7]或者衍生化方法[8]對其進行檢測，但蒸發光散射檢測器靈敏度相對較差，在待測成分含量較低時表現不佳，且待測成分的峰純度無法考證，而衍生化方法的操作較繁瑣。八寶驚風散處方藥味復雜，人工牛黃處方量小，基質干擾嚴重，筆者前期嘗試采用普通液相色譜法進行分析，未能成功。因此，本研究采用靈敏度和選擇性均更高的超高效液相串聯質譜法進行測定。

3.2 色譜條件及質譜條件的確定

本課題組前期考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液4個溶劑系統，結果表明，水相采用純水或乙酸銨溶液，有機相采用甲醇或乙腈對分離的影響均不大；考慮到乙腈柱壓更小，添加乙酸銨與否對分離及靈敏度無影響，故最終選用了乙腈-水作為流動相。本課題組還考察了等度和梯度洗脫的區別，結果發現，梯度洗脫峰形較好，且梯度洗脫對樣品中吸附在色譜柱上的強保留雜質有較好的洗脫作用，有利于延長色譜柱的壽命。因膽汁酸類成分含有羧基，易形成負離子，因此質譜離子源采用了負離子模式電離。本課題組還比較了單四極桿模式及多反應監測模式，結果發現，膽酸、豬去氧膽酸、牛磺膽酸鈉的分子離子均有較大響應，但采用多反應監測模式的二級碎片離子響應較小。為了使建立的方法更加靈敏，本研究選用了單四極桿模式。

3.3 提取方法的考察

本課題組前期比較了甲醇直接提取和樣品加稀鹽酸酸化后再以氯仿提取兩種提取方法，結果表明，兩種方法均能提取出膽汁酸類成分，但酸化后再用氯仿提取的樣品測得值（編號A1樣品中膽酸、豬去氧膽酸、牛磺膽酸鈉含量分別為1.013、1.230、1.034 mg/g）較甲醇直接提取（見表2樣品A1數據）的含量低，且操作復雜，故本研究選擇用甲醇直接提取。

4 結語

本研究建立了超高效液相串聯質譜法同時測定八寶驚風散中膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉含量的方法，該方法線性范圍寬，專屬性和重復性良好，能夠在15 min內快速實現對目標成分的分離，并能很好地區分八寶驚風散批間及不同廠家之間的差異。3個廠家樣品之間膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉含量存在一定差異，這可能與廠家所用人工牛黃原料不同和生產工藝存在差異有關。由于本研究所用的八寶驚風散均為市售品，無法取得相應批次制劑生產投料的人工牛黃飲片，故僅能通過檢測制劑中3個膽汁酸類成分的含量間接分析制劑生產工藝的均一性。后續本課題組將進一步收集相關樣品及人工牛黃飲片，以進一步明確不同廠家3個膽汁酸類成分含量均一性不佳的原因。