參苓白術散調控TLR4/NF-κB 通路抑制LPS 誘導心肌細胞炎性損傷的機制

黃 娟，王一陽，肖 凡，劉 秀，喻 嶸*

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是糖尿病主要的心血管并發癥之一，是糖尿病患者心力衰竭高發生率和高死亡率的主要病因[1-2]。 目前，DCM 的發病機制及診治方面的研究尚有許多未知領域和難點。 近年研究認為，DCM 是心肌在長期高血糖狀態下發生的一種慢性炎癥性疾病[3]。 研究報道，糖尿病患者的血清和糖尿病動物模型的心肌組織中，多種炎癥因子的表達水平顯著升高[4-5]。因此，早期抑制炎癥級聯反應是防治DCM 的一個新靶點。 Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）作為炎癥反應的重要受體及機體免疫防御系統中的重要組成，是免疫反應與慢性炎癥的橋梁[6]。 但TLR4是否介導DCM 早期炎癥損傷的發生發展，需要進一步探究。

新近研究表明，腸道菌群具有內分泌器官的特征，可通過調節機體代謝及免疫炎癥反應影響糖尿病心肌病的病理進程[7]。 腸道微生物群落參與機體免疫細胞的分化成熟，生理狀態下，腸上皮細胞結構完整并通過宿主模式識別受體，調控菌群結構，維持內環境穩態；當腸黏膜屏障損傷時，通透性增加，大量促炎物質[如脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）]通過通透性升高的腸屏障進入血液循環到達心臟組織，直接激活TLR4 相關通路，誘導病原相關模式分子信號活化，觸發局部炎癥級聯反應；另一方面，心肌細胞功能缺失，并出現大量細胞死亡，與黏附因子相互作用產生炎癥效應，引起心肌纖維化及心室重構等病理狀態出現[8-9]。 前期臨床研究表明，以益氣健脾立法組方的參苓白術散可調節糖脂代謝，對心血管疾病療效確切[10]。 同時，體內實驗證實，其可改善脂代謝和減少腸道炎癥因子釋放，減緩血管病變的風險，抑制免疫炎癥反應過度損傷，但其靶向調控心血管的機制需要進一步研究[11-12]。 故本研究進行體外細胞實驗研究，擬以心肌細胞作為研究對象，從免疫炎癥角度出發，探討參苓白術散含藥血清對腸道代謝物LPS 介導的TLR4/核因子κB（nu clear factor-κB, NF-κB）信號通路及炎癥相關因子白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）表達的影響。

1 材料

1.1 動物與細胞株

20 只8 周齡SD 雄性大鼠，體質量200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心進行飼養；溫度（22±2） ℃，濕度50%～65%，自由飲食、飲水，12 h/12 h光/暗周期（光照時間為6:00～18:00）。 本研究經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：430727221101382931。 大鼠H9C2 心肌細胞（批號：CL-0089），購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 藥物

參苓白術散由人參、茯苓、白術（炒）、山藥、白扁豆（炒）、蓮子、薏苡仁（炒）、砂仁、桔梗、甘草組成，批號：22101037，國藥準字號：Z110020755，購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（批號：SA210518）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號：WH0221A171）、高糖DMEM 培養基（批號：WH0022P299）、PBS 緩沖液（批號：AD17792273）、CCK-8 檢測試劑盒（批號：AI07246697）、無血清細胞凍存液（批號：WH0221A091）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；兔抗TLR4 多克隆抗體（批號：ab13556）、兔抗核因子κB p56（nuclear factor-κB p56,NF-κB p56）單克隆抗體（批號：ab207297）、兔抗NFκB 抑制蛋白α（degradation of protein κB-α, IκBα）單克隆抗體（批號：ab32518）；兔抗TNF-α 單克隆抗體（批號：ab215188）、兔抗IL-1β 單克隆抗體（批號：ab234437）均購自英國Abcam 公司。

SW-CJ-2G 型超凈工作臺（美國Thermo Scientific 公司）；TGL-18R型冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）；YP1002N 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；EnSpire2300 型多功能酶標分析儀（新加坡PerkinElmer 公司）；JSM-6700F 型掃描顯微鏡（日本Jeol 公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備

將20 只SD 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分成2 組：空白血清組、參苓白術散含藥血清組，每組10只。 給藥劑量為等效劑量的5 倍，依據體表面積方法換算[13]，參苓白術散含藥血清組大鼠用藥劑量=（5×12 g×6.3）/70 kg=5.4 g/kg，給予參苓白術散藥液灌胃；空白血清組采用等容量的滅菌超純水灌胃，每日1 次，連續7 d。 末次灌胃1 h 后，腹主動脈取血，用含肝素抗凝管收集血液，靜置3 h 后；以3 000 r·min-1離心（離心半徑10 cm）15 min，收集上層血清，0.22 μm一次性濾過器過濾，56 ℃恒溫水浴鍋滅活30 min；將滅活的血清分裝至無菌EP 管中標記，置于-80 ℃保存。

2.2 含藥血清濃度篩選

取對數生長期的H9C2 細胞接種于96 孔板中，按照每孔100 μL、每孔5×103個細胞，在5%CO2、37 ℃條件下培養24 h，棄去培養基，設空白對照組、空白血清組及含藥血清組，設置5%、10%、15%、20%、25%的濃度梯度。 培養24 h 后，吸棄上清液，每孔加入CCK-8 溶液10 μL 及完全培養基90 μL，2 h 后用酶標儀在450 nm 波長處檢測各組細胞的OD 值。

2.3 細胞分組及處理

H9C2 細胞用10%胎牛血清DMEM 培養液調整細胞密度為5×104/mL，接種于6 孔板中，予以10 μg/mL LPS 干預處理24 h 后收集細胞。隨機分成空白血清組（10%空白血清）、模型組（10 μg/mL LPS+10%空白血清）、參苓白術散含藥血清組（10 μg/mL LPS+10%參苓白術散含藥血清）及TAK-242組（10 μg/mL LPS+5 μmol/L TAK-242[14]）。

2.4 CCK-8 法篩選含藥血清干預濃度

H9C2 細胞以5×104mL-1密度接種至96 孔板中，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h；吸棄培養基后，分別加入稀釋后的胎牛血清、空白血清及含藥血清，每組設置5%、10%、15%、20%、25%的濃度梯度，每組均設6 個復孔。干預處理24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液及90 μL 完全培養基，培養箱孵育2 h 后采用酶標儀在450 nm 波長下檢測各組細胞的OD 值。

2.5 ELISA 法檢測細胞IL-1β、TNF-α 含量

取生長良好的H9C2 細胞按照分組干預后，吸取細胞上清液，以3 000 r·min-1（離心半徑15 cm）離心20 min，取上清液檢測。 分別設空白孔、待測樣品孔。 在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；每孔加入酶標試劑100 μL，空白孔除外；用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min；棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去；每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；加終止液50 μL，終止反應；以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的OD 值，計算IL-1β、TNF-α 含量變化。

2.6 免疫熒光法檢測IL-1β、TNF-α 蛋白表達

將H9C2 細胞按照每孔1×105個細胞接種于含細胞爬片的6 孔板。按照分組加入相應藥物干預，培養24 h 后，以4%預冷的多聚甲醛溶液對細胞進行固定（15 min），PBS 溶液洗3 遍后加入5% BSA 封閉30 min，加入稀釋的IL-1β、TNF-α（1∶50）一抗孵育過夜；滴加稀釋的IgG/FITC 二抗孵育60 min；洗滌后復染核，然后進行封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot 法檢測TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達

將H9C2 細胞以5×105/mL 的細胞密度接種于6孔板中，細胞培養24 h 后，按照分組加入相應藥物干預，培養24 h 后，棄培養上清液，用PBS 洗滌2次，加入適量RIPA 裂解液重懸；低溫下勻漿后將樣品轉移至1.5 mL 離心管中，以12 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心5 min，取上清液分裝。 采用BCA法測定蛋白濃度后，進行丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜切膠后封閉，加入一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）抗體，4 ℃下孵育過夜；PBST洗膜3 次，加入HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000）、山羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗，室溫孵育90 min。PBST洗膜3 次，ECL 顯色液中顯影1 min，沖洗膠片、掃描。

2.8 統計學方法

采用SPSS 22.0 進行統計處理。 計量資料滿足正態性和方差齊性者用“±s”表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較用LSD 檢驗；不滿足正態性和方差齊性者用Tamhane's T2 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 參苓白術散含藥血清對H9C2 細胞增殖的影響

與空白對照組相比，參苓白術散含藥血清組及空白血清組在10%濃度水平的OD 值差異無統計學意義（P＞0.05）；而參苓白術散血清濃度為5%、15%、20%、25%時，OD 值明顯降低，細胞增殖受到抑制，差異有統計學意義（P＜0.01）。 結果表明，10%參苓白術散含藥血清對H9C2 細胞無明顯毒性作用，故以此濃度作為后續實驗含藥血清的干預濃度。詳見圖1。

圖1 各組H9C2 細胞增殖情況比較（±s，n=6）

3.2 參苓白術散含藥血清對H9C2 細胞中TNF-α、IL-1β 水平的影響

與空白血清組相比，模型組H9C2 細胞釋放的TNF-α、IL-1β 含量增加（P＜0.01）。 與模型組相比，參苓白術散含藥血清組及TAK-242 組細胞中的TNF-α、IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01）。 詳見圖2。

圖2 各組H9C2 細胞中TNF-α、IL-1β 水平比較（±s，n=6）

3.3 參苓白術散含藥血清對H9C2 細胞IL-1β、TNF-α 蛋白表達的影響

與空白血清組比較，模型組H9C2 細胞的IL-1β、TNF-α 的平均OD 值明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，參苓白術散含藥血清組及TAK-242 組細胞的IL-1β、TNF-α 平均OD 值明顯下降（P＜0.01）。 詳見圖3。

圖3 各組H9C2 細胞IL-1β、TNF-α 蛋白表達比較（±s，n=6）

3.4 參苓白術散含藥血清對H9C2 細胞TLR4、NFκB p65、IκBα 蛋白表達的影響

與空白血清組相比，模型組H9C2 細胞內TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。 與模型組相比，參苓白術散含藥血清組及TAK-242 組細胞的TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表達減少（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 各組H9C2 細胞TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表達比較（±s，n=6）

4 討論

據最新國際糖尿病聯盟的數據統計，目前全球約有4.25 億糖尿病患者，且呈現逐年上升的趨勢，預計到2045 年將達到7 億[15]。持續的血糖增高可誘導機體代謝紊亂、免疫炎癥反應及氧化應激等多種病理狀態出現，引起機體組織及細胞的損傷，而糖尿病心血管并發癥是糖尿病患者的主要死亡原因[16]。DCM 是糖尿病常見并發癥之一，是獨立于冠心病及高血壓的特異性心肌病，其發病機制尚未完全闡明。糖尿病心肌病既有“消渴”癥狀，也存在“心病”表現。中醫學認為，先天不足或后天失養及他臟病變累及脾胃，可導致其胃火偏盛，脾陰虧損，運化不能，氣機失暢，水谷精微疏布失常，痰濁內生。病程遷延不愈，氣陰耗傷，久病內舍于心，心氣不足，運血無力，心陰虧虛，則燥熱內盛，暗耗心血，瘀滯內生。 脾不散精是DCM 的中醫病機關鍵，故選用參苓白術散，探究從脾治心的科學內涵。 方中君藥人參、白術、茯苓益氣健脾，滲濕化濁；臣以蓮子、山藥補氣生津；合用白扁豆、薏苡仁、砂仁健脾滲濕，行氣化滯；桔梗宣通肺氣，載藥上行于心肺為佐；甘草健脾和中，調和諸藥。 全方以補中氣、滲濕濁、行氣滯為要。 近年來，隨著腸道微生態相關內容的研究深入，發現腸道菌群與DCM 的發生密切相關[17-18]。 腸道菌群與宿主免疫系統相互協調平衡，維持機體內環境穩態。 正常狀態下，腸道屏障功能能夠抑制病原微生物的蓄積及移位，并通過宿主模式識別受體（pattern recognition receptor, PRR）感知微生物的異常活動，激活免疫反應識別清除；而病理情況下，出現腸道滲漏、腸屏障功能降低、腸道通透性升高，伴隨腸道菌群豐度及結構變化，可觸發局部炎癥反應，大量釋放的炎癥因子可進入循環，發生移位，靶向損傷心肌細胞[19-20]。微生物相關模式分子和LPS 是腸道菌群與宿主相互作用的主要介質，可與PRR 識別結合，直接作用于免疫系統，并誘導炎癥級聯反應，促進DCM 的發生發展。

TLR4 是一種廣泛表達于心肌細胞表面的PRR，可響應不同病原相關分子模式，啟動識別、靶向結合并誘導一系列的信號傳輸，在機體內環境免疫炎癥調控中具有重要作用，與心血管疾病緊密相關[21-22]。 持續的代謝紊亂狀態及氧化應激可觸發機體免疫炎癥反應，TLR4 可識別并激活機體的免疫細胞，促使炎癥介質及趨化因子釋放，同時活化經典的下游炎癥信號轉錄因子NF-κB。 在靜息狀態下，NF-κB 常以2 個亞單位p65 和p50 結合成異源二聚體，與IκB 抑制蛋白家族結合，形成一個穩定的三聚體，存在于細胞質中[23-24]。IκBα 是IκB 家族中的一員，是NF-κB 蛋白的主要抑制劑，當受到細胞外信號刺激時，IκBα 發生泛素化、磷酸化并降解，IκB從三聚體中解離出來，釋放p65/p50，進行核移位，使其移至細胞核與靶基因啟動區或增強子的NFκB p65 位點結合，上調IL-6、IL-8、TNF-α 等促炎因子的表達[25-26]。 IL-1β、TNF-α 可協同介導免疫炎癥反應的級聯放大[27]。 IL-1β 是炎性反應啟動因子，應激狀態下，以前體形式剪切活化，IL-1β 釋放增加可促進血管細胞分泌大量的黏附因子，介導氧自由基及炎性遞質蓄積[28]。 同時，可上調TNF-α 的合成與表達，激活凋亡通路，加快心肌細胞凋亡[29-30]。 本研究以LPS 作為誘導劑，模擬“腸漏”狀態下，LPS 通過循環誘導心肌細胞炎癥損傷的過程。 采用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率，篩選含藥血清濃度，10%參苓白術散含藥血清對細胞增殖狀態無明顯影響，故選做實驗含藥血清干預濃度。 研究結果顯示，參苓白術散含藥血清可有效抑制H9C2 細胞中TNF-α、IL-1β 的含量，降低炎癥因子的釋放。 H9C2 細胞在LPS 刺激后，可激活炎癥相關通路，參與細胞炎性損傷過程。 本研究中，與空白血清組比較，LPS 誘導的模型組H9C2 細胞TLR4、NF-κB p65、IκBα 及TNF-α、IL-1β 蛋白表達明顯上調，繼發的炎性反應明顯。 而參苓白術散含藥血清可抑制TLR4/NF-κB通路蛋白表達，其中NF-κB p65 活化后的核移位效應可促進成熟的IL-1β、TNF-α 蛋白表達變化，并促進其分泌至細胞外，引起炎性反應，其作用效應與TLR4 抑制劑相當。 參苓白術散含藥血清組IL-1β、TNF-α 蛋白表達差異與TLR4、NF-κB p65、IκBα 的結果具有一致性。

綜上所述，參苓白術散含藥血清可能通過細胞炎癥信號通路TLR4/NF-κB，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 的釋放與表達，阻斷慢性炎性反應的持續過程，維持心肌細胞正常功能狀態。本研究進一步驗證參苓白術散通過抑制炎癥機制調控LPS 對心肌細胞的損傷效應，為臨床診療DCM 的應用提供依據。