燈盞花素對大鼠糖尿病視網膜水腫PKCβ 及VEGF 蛋白表達的影響

胡卓瑜，王 萱，胡 齊，劉 靜，黃櫳瑢，付美林，劉志敏，陳向東*

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007；3.中醫藥防治眼耳鼻喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙410208

糖尿病黃斑水腫（diabetic macular edema, DME）是高血糖環境下黃斑區血－視網膜屏障（blood-retinal barrier, BRB）受損所導致的。 黃斑區生成的水腫液壓迫神經元，從而引起糖尿病患者視力喪失[1-2]。而視網膜水腫是由于液體聚集在視網膜組織間隙中，在液體的壓力下，神經細胞變性、壞死，加重組織缺血缺氧，損傷糖尿病患者的視功能。 報道顯示，糖尿病視網膜病變患者并發黃斑水腫的概率為2.7%～11%，其發病主要受糖尿病病程、血壓以及糖化血紅蛋白指數的影響[3]。 現階段，歐洲視網膜專家協會指出DME 的治療主要以激光光凝治療、抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）藥物治療、激素治療和手術治療為主。其中，抗VEGF 藥物的注射是目前的一線治療方式，在提高視力、減輕黃斑水腫方面有效[4]，但其價格昂貴、周期長、需反復注射，并且會帶來腎功能異常、血栓性微血管病變的風險，使得黃斑水腫患者在尋求治療過程中望而卻步[5-6]。

糖尿病視網膜水腫的病理過程可概括為長期的糖代謝紊亂下視網膜缺血、缺氧，糖基化終末產物（advanced glycosylation end product, AGE）與糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products, RAGE）結合發揮生物效應，同時高糖環境促使二酰甘油（diacylglycerol, DAG）水平的增高，激活蛋白激酶C（protein kinases C, PKC）[7]。 其中，蛋白激酶Cβ（PKCβ）的活化被證實是糖尿病微血管病變的關鍵蛋白[8]。 同時，PKC 通路能改變一氧化氮生物利用度、調控血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達，影響血管張力和通透性，導致內皮細胞損傷[9]。另一方面，VEGF 通過增加緊密連接蛋白的磷酸化促進內皮細胞繁衍增殖，造成BRB 損傷，大大增加了血管的通透性，加快了大分子物質滲漏進入視網膜組織間，使積液聚集于視網膜內核層與外叢狀層間，最終導致視網膜組織細胞間水腫[10]。

近年來，中醫藥在治療糖尿病視網膜水腫中頗有成就，具有改善視網膜微循環、減輕毛細血管通透性、減少微血管瘤數量的作用，可下調VEGF 表達以保護BRB[11]。 前期研究發現，運用活血化瘀類中藥可改善糖尿病視網膜病變患者眼底微循環，抑制炎癥反應，以保持BRB 的完整性和穩定性，抑制新生血管的生長[12]。 具有活血化瘀功能的中藥燈盞花屬于菊科飛蓬屬的生草本植物，首載于《滇南本草》：“燈盞花……左癱右瘓，風濕疼痛……”[13]主要應用于跌打損傷，具有活血止痛的作用。 現代藥理學發現，燈盞花素是從燈盞花中提取出的黃酮類有效成分，可以增加血流量，改善微循環，擴張血管，降低血液黏度，并在治療糖尿病心肌病、糖尿病腎病、視網膜病變等方面卓有成效[14]。 本研究通過建立鏈脲霉素（streptozotocin, STZ）聯合高糖高脂飲食誘導SD 大鼠糖尿病模型，并結合光學相干斷層成像術（optical coherence tomography, OCT）以及HE 染色檢測視網膜水腫程度，對燈盞花素減輕糖尿病視網膜水腫、潛在靶點蛋白及BRB 的保護作用進行系統研究，為進一步臨床實驗提供依據。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠36 只，鼠齡8～10 周，體質量（180±20） g，由湖南中醫藥大學SPF 級動物中心提供。 動物分籠飼養于湖南中醫藥研究院動物中心實驗室，飼養溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。 進行為期1 周的適應性喂養，然后將SD 大鼠隨機分成正常組和造模組。 本研究實驗動物及條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規定，由湖南省中醫藥研究院動物實驗福利倫理審查委員會批準（倫理審批號：2020-0061）。

1.2 主要試劑

羥苯磺酸鈣（商品名：安多明，貴州天安藥業股份有限公司，批號H20010481）；STZ、Tris（美國Sigma公司，批號：08E221108、V900483）；燈盞花素（廣州彼迪藥業有限公司，批號：Z44023596）；檸檬酸、檸檬酸鈉(上海展云化工有限公司，批號：20201105、20210119）。HE 染色液、PBS（7.2～7.6）、枸櫞酸鹽緩沖液（Wellbio，批號：05A210219、11A210301、01A210302）；RIPA 裂解液（中國上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）；APS、吐溫-20（國藥集團上海有限公司，批號：10002618、30189328）；SDS（中國大連美倫生物技術有限公司，批號：MB2479）；TEMED（中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司貨號，批號：T105497）；VEGF 抗體、PKCβ 抗體、β-actin 抗體、occludin 抗體、HRP 山羊抗鼠IgG、HRP 山羊抗兔IgG（美國蛋白技術集團公司，批號：19003-1-AP、12919-1-AP、66009-1-Ig、27260-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；Claudin-5 抗體（賽默飛世爾科技有限公司，批號：35-3500）。

1.3 主要儀器

光學相干斷層掃描儀（德國海德堡公司，型號：Spec-CAM-05529-S2000）；臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀實驗儀器開發有限公司，型號：H1650R）；全自動酶標洗板機、多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：PW-812、MB-530）；電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，型號：DHP-500）；電泳儀、轉膜儀、電泳槽（中國北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-40D、DYCZ-24DN）；旋渦混合器、搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B、TS-1）。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的制備

36 只SD 雄性大鼠自由飲水飲食，適應性喂養1 周后，禁食14 h 后稱重編號，隨機分為正常組(n=9)和造模組(n=27)。 造模組使用高脂高糖飼料（飼料為湖南中醫藥研究院動物實驗中心提供）喂養2 周，大鼠每天攝入飼料30～40 g，控制其食量。待2 周后，空腹12 h 后稱重編號， 按30 mg/kg 劑量一次性腹腔注射STZ，正常組腹腔注射等量的生理鹽水。STZ腹腔注射72 h 后取尾靜脈血測SD 大鼠空腹血糖，測得血糖穩定在16.7 mmol/L 并表現為多飲、多食、多尿者則為建立糖尿病大鼠模型成功[15]。若大鼠血糖＜16.7 mmol/L，則追加注射等劑量STZ，從模型建立成功1 周后開始計算病程。

2.2 糖尿病視網膜水腫模型的制備與分組

自糖尿病模型造模開始時，每4 周選擇1 只正常組大鼠與1 只造模組大鼠，HE 染色觀察大鼠視網膜是否存在組織紊亂不均的情況，并發現視網膜厚度高于（209.78±3.62） μm 即為造模成功[16]。8 周時確認造模成功后，將糖尿病視網膜水腫大鼠隨機分為模型組9 只、安多明組9只、燈盞花素組9 只。模型組大鼠給予10 mL·kg-1生理鹽水灌胃。 根據人與大鼠體表面積換算，人的臨床劑量換算為大鼠等效劑量灌胃安多明0.09 g·kg-1，燈盞花素組給予0.002 g/kg，按10 mL·kg-1·d-1灌胃給藥，均治療4 周。 實驗過程死亡大鼠嚴格按照上述造模方式補齊。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠的一般情況 觀察大鼠的飲食情況、體質量、精神狀態。 造模前1 周，造模后2、4、8 周，以及用藥后的1、2、4 周后的早上，稱取大鼠體質量、空腹血糖并記錄。

2.3.2 HE 染色觀察造模前后視網膜結構變化 正常組以及模型組的大鼠分別在造模后4、8 周各處死1只，進行眼球的取材，然后進行HE 染色，具體步驟如下：蒸餾水沖洗視網膜組織10 min，PBS 返藍；伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度乙醇（95%～100%）脫水，60 ℃烤片1～2 h；切片脫蠟至水：二甲苯中放切片約10 min，2 次，然后依次在100%、100%、95%、85%和75%乙醇中，每級放置5 min。 再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染色5 min。 取出后置于二甲苯維持10 min，2 次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。 用藥4 周后以同法對各組視網膜結構進行HE 染色。 應用同法處理造模后大鼠的腎臟組織，觀察其變化。

2.3.3 OCT 觀察視網膜厚度變化 造模開始之前，麻醉機吸入2 mL/L 異氯烷麻醉，符大鼠全身麻醉成功后，并用復方托吡卡胺滴眼液擴瞳，然后玻璃酸鈉滴眼液滴眼，保持大鼠角膜濕潤狀態。 待老鼠反應遲緩后，包裹全身，暴露待檢鼠眼，用OCT 對各組大鼠進行眼底檢查。進行OCT 檢查時測量距離視盤上方、下方、鼻側、顳側4 個方向2 個視盤直徑（disc diameter, DD）處的視網膜厚度（視網膜內界膜至視網膜色素上皮高反射層）并記錄，檢查完予以鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠預防角膜干燥。 使用檢測系統的自帶軟件手動測量視網膜厚度。于用藥前（造模后8周）及用藥4 周后，以同法對各組進行OCT 檢查，觀察視網膜厚度變化。

2.3.4 Western blot 檢測VEGF、PKCβ 蛋白表達 分離眼后節視網膜組織，用PBS 洗浴1 次，制備10%分離膠及4.8%濃縮膠，取待測蛋白樣本80 μL 進行凝膠電泳。用10% PAGE 負載蛋白，然后將其轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶進一步封閉PVDF 膜，膜與特異性一抗VEGF、PKCβ，4 ℃雜交過夜。 次日放置30 min 后，加入兔抗大鼠VEGF 一抗（1∶1 000）、兔抗大鼠PKCβ 一抗（1∶500）和小鼠抗大鼠β-actin 一抗（1∶5 000）孵育90 min，結束后用PBS 液沖洗3次。 用TBST 洗后將PVDF 膜放入裝有HRP 標記的山羊抗鼠二抗（1∶5 000）、山羊抗兔二抗（1∶6 000）孵育90 min，然后用TBST 洗3 次，每次15 min。 使用ECL 化學發光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內與X 膠片曝光5～20 min；顯影沖洗。 并使用Image J 軟件進行分析，蛋白表達量以目的蛋白灰度值與β-actin 灰度值的比值表示。

2.3.5 ELISA 法檢測VEGF、PKCβ 含量 全麻下分離腹主動脈采血，用肝素抗凝管采血。將室溫血液自然凝固10～20 min，離心約20 min（3 000 r/min），取上清液進行檢測；或進行分裝，并將標本放于-20 ℃或-80 ℃保存，禁止反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后依據試劑盒步驟檢測VEGF、PCKβ 的表達量。

2.3.6 免疫組織化學檢測claudin-5、occludin 蛋白表達水平 采用兩步法，眼球組織標本（取3 只大鼠標本）石蠟包埋，制成4 μm 常規切片，脫蠟及梯度脫水后，經3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，高壓修復抗原后，滴加兔抗鼠occludin、小鼠抗大鼠claudin-5 抗體（稀釋濃度分別為1∶100、1∶100）置于濕盒，4 ℃冰箱過夜。 次日復溫后滴加抗-兔、兔-IgG 抗體-HRP 多聚體，于37 ℃溫箱孵育30 min。 經DAB 顯色，蘇木素復染，二甲苯透明封片。 所有切片用濱松Nano Zoomer 2.0RS 掃描成像，每個切片圖像400 倍放大后截取3 個視野，采用IPP 6.0 進行圖像分析，分析結果為總光密度，取平均值為蛋白表達強度。

2.4 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行統計處理，兩組進行比較，滿足正態分布及方差齊性，采用獨立樣本t 檢驗；否則采用秩和檢驗。多組數據進行比較時，滿足正態分布及方差齊性，采用方差分析；否則采用Kruskal-Wallis 檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 為差異有顯著統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況變化

注射STZ 后，模型組、安多明組及燈盞花素組的大鼠大鼠體質量增長緩慢，并有體質量下降趨勢。在造模后2、4、8 周以及給藥后1、2、4 周，與空白組對比，模型組、安多明組、燈盞花素組體質量增長較慢（P＜0.01）；在給藥后1 周，與模型組對比，安多明組體質量增長較少（P＜0.05）；在給藥后2 周，與安多明組對比，燈盞花素組體質量增長較多（P＜0.01）；在給藥后4 周，與模型組、安多明組對比，燈盞花素組體質量增長較多（P＜0.01）（圖1）。 注射STZ 后，與空白組對比，其他組大鼠血糖>16.7 mmol/L（圖2）。在造模后2、4、8 周以及給藥后1、2、4 周，與正常組對比，模型組、安多明組、燈盞花素組血糖顯著升高（P＜0.01）。在給藥后2 周，與模型組對比，燈盞花組血糖降低（P＜0.05）（圖2）。

圖1 大鼠體質量變化圖（±s，n=9）

圖2 大鼠血糖濃度變化圖（±s，n=9）

3.2 視網膜形態組織學改變

4 周后正常組大鼠視網膜層間結構清晰，排列整齊致密（圖3A）；而造模4 周后造模組視網膜結構較為疏松（圖3B）；造模8 周后造模組細胞排列紊亂，可見明顯疏松，數目減少，內界膜、神經纖維層、內外核狀層腫脹，細胞呈空泡樣改變（圖3D）；而正常組未見明顯的異常（圖3C）。

圖3 造模后正常組與造模組的HE 染色圖（×400）

用藥4 周后，與正常組對比，模型組可見視網膜神經節細胞呈空泡樣改變，內叢狀層、外叢狀層排列紊亂，內核層、外核層細胞密度減少，排列疏松（圖4B）。 安多明組視網膜神經節細胞仍呈空泡樣改變，內核層、外核層的水腫未見明顯改變（圖4C）。 燈盞花素組視網膜結構較安多明組緊密，層間水腫不明顯，層次結構清晰（圖4D）。

圖4 用藥4 周后各組的HE 染色圖（×400）

3.3 各組視網膜厚度變化

給藥前，與正常組對比，模型組視網膜厚度增加（P＜0.01），表明出現視網膜水腫（圖5A）。給藥后，安多明組、燈盞花素組與模型組對比，視網膜厚度均下降（P＜0.01）（圖5B2—4）。 給藥4 周后，燈盞花素組大鼠視網膜厚度接近于正常水平（表1）。 由于后期部分大鼠出現白內障或屈光間質不清，故OCT 檢查成像模糊或窺不清。

表1 各組大鼠給藥前后視網膜厚度比較（±s，μm）

表1 各組大鼠給藥前后視網膜厚度比較（±s，μm）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別正常組模型組安多明組燈盞花素組F 值P 值n9999給藥前198±3.53 218.33±2.58▲▲219.77±4.94▲▲218.67±2.71▲▲61.701 P＜0.01給藥后200.89±3.00 220.44±4.47▲▲213.11±4.63▲▲△△209.78±3.08▲▲△△35.11 P＜0.01

圖5 用藥前后視網膜厚度OCT 對比

3.4 Western blot 檢測視網膜PKCβ、VEGF 的表達情況

與正常組對比，模型組、安多明組視網膜組織中PKCβ、VEGF 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，安多明組、燈盞花素組的PKCβ、VEGF 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中安多明組PKCβ 差異有統計學意義（P＜0.05），安多明組VEGF 水平和燈盞花素組的PKCβ、VEGF 水平差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）；與安多明組相比，燈盞花素組PKCβ 水平下降（P＜0.05）。 詳見圖6。

圖6 各組視網膜組織PKCβ、VEGF 的表達情況（±s）

3.5 ELISA 檢測血清PKCβ、VEGF 的表達情況

與正常組對比，模型組、安多明組、燈盞花素組血清中PKCβ、VEGF 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，安多明組、燈盞花素組的PKCβ、VEGF 水平顯著降低（P＜0.01）；與安多明組相比，燈盞花素組PKCβ、VEGF 水平下降（P＜0.05）。 詳見圖7。

圖7 各組血清PKCβ、VEGF 的表達情況（±s）

3.6 免疫組織化學法檢測視網膜claudin-5、occludin 的表達情況

給藥4 周后，模型組的組內界膜、色素上皮層、內外叢狀層細胞胞漿中claudin-5 的染色較淺，且視網膜組織排列紊亂，結構稀疏，安多明組染色與模型組相比相對較深。 燈盞花素組的視網膜組織claudin-5、occludin 表達呈陽性，排列相對整齊，結構致密。與正常組對比，模型組、安多明組及燈盞花素組視網膜組織中claudin-5、occludin 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，安多明組的claudin-5、occludin水平升高（P＜0.05）。 與模型組對比，燈盞花素組的occludin 水平顯著升高（P＜0.01），claudin-5 水平升高（P＜0.05）。 詳見圖8 和表2。

表2 各組大鼠視網膜claudin-5、occludin 的表達情況（±s）

表2 各組大鼠視網膜claudin-5、occludin 的表達情況（±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與安多明組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組安多明組燈盞花素組F 值P 值n3333 claudin-5 0.027 5±0.003 4 0.009 1±0.000 7▲▲#0.014 1±0.001 0▲▲△0.014 1±0.001 7▲▲△69.62＜0.01 occludin 0.149 5±0.008 0 0.052 0±0.002 0▲▲0.088 8±0.021 4▲▲△0.102 0±0.014 2▲▲△△32.45＜0.01

圖8 各組大鼠視網膜claudin-5 與occludin 的表達情況

4 討論

在糖尿病視網膜病變發展過程中由于血管通透性的改變，液體聚集在有限空間內，使得視網膜外叢狀層形成囊樣改變，導致黃斑水腫的發生。 DME 的發生機制尚未闡明，其本質是視網膜毛細血管內皮細胞受損，內皮細胞通透性增大，使得血-視網膜屏障功能破壞，涉及氧化應激、炎性因子及VEGF 的積累，從而加重黃斑區水腫[17-18]。 PKC 是VEGF 促進血管形成的信號轉導分子，可增加血管內皮細胞通透性，改變視網膜血管血流狀態。 當機體處于糖代謝紊亂情況，視網膜血管組織的DAG 水平升高，從而激活PKC 及下游多條通路，改變血管通透性、促進血管生成及細胞因子反應[19]；AGE 與RAGE 受體相互作用可激活PKC[20]；活性氧激活PARP 并與己糖胺和PKC 通路共同作用，促進氧化應激反應，誘發慢性炎癥損害[21]。研究表明，PKC 參與細胞生長與分化相關的基因表達的調控，在DME 的發展過程中發揮重要作用，PKCβ 抑制劑的應用能有效降低患者致盲率，緩解視網膜水腫[22-23]，因此，PKCβ 抑制劑廣泛應用于治療糖尿病誘發的黃斑及視網膜水腫。

VEGF 是最強的促血管生長因子，其表達水平與微血管形成數呈正相關，廣泛存在于玻璃體、視網膜中，正常情況下，促進血管生成因子與抑制血管生成因子相互協調，使機體達到平衡狀態[24]。若個體長期處于糖代謝紊亂狀態，正常的機體功能受損后激活PKC，活化的PKC 介導VEGF 生成，促使血管生成因子占據主導地位，抑制緊密連接的表達[25-26]。 生長因子會介導血管通透性增大，緊密連接結構變得紊亂無序，因此，VEGF 是破壞BRB 的重要介質，具誘發視網膜水腫、血管滲漏的元兇[27]。

BRB 正常功能的發揮主要依賴于緊密連接蛋白的完整性，claudin-5、occludin 及ZO-1 是3 種研究最為廣泛的緊密連接蛋白。 其中occludin 及claudin為跨膜蛋白，同時具有胞內環和胞外環，胞外環通過“拉鏈”狀形式連接細胞并產生細胞旁封閉，與胞內ZO 蛋白共同形成緊密連接，參與維持和調節極性細胞的屏障功能[28]。 而STZ 誘導下會使得糖尿病大鼠視網膜claudin-5、occludin、ZO-1 蛋白減少，微血管通透性增大，破壞BRB 的屏障功能[15，29]。實驗研究表明，玻璃體腔注射VEGF 抑制劑能有效抑制claudin-5、occludin 的表達下調，保護SD 大鼠的BRB功能[30]。可見，糖尿病視網膜水腫的發生可能與高糖環境下激活PKC 信號通路相關，活化的PKC 介導VEGF 上調，VEGF 磷酸化緊密連接蛋白進一步破壞BRB，通過阻斷PKC 的激活可以減少水腫的發生。

臨床研究與實驗研究顯示，燈盞花素具有較強的抗新生血管的作用，能有效增加血流量，擴張血管，降低血液黏度，抑制血小板聚集和血栓形成[31]，同時也扮演著PKC 抑制劑的重要角色[32]，為糖尿病微血管病變的治療開辟新思路。 燈盞花素能調控人視網膜色素上皮細胞VEGF 及其受體VEGFR2 下游相關蛋白，阻止絲裂原活化蛋白激酶通路的激活[33]，通過抑制p-ERK、p-FAK 和p-Src 蛋白的表達[34]，發揮抑制新生血管的作用，阻止糖尿病視網膜病變進一步發展，減少黃斑水腫、出血、滲出的風險。

本研究通過STZ 聯合高糖高脂飼料誘導DM大鼠模型，并于造模后4、8 周聯合OCT、HE 染色觀察視網膜水腫的情況，用藥后觀察燈盞花素對STZ誘導糖尿病視網膜水腫大鼠視網膜組織的影響。 本實驗結果顯示，與模型組對比，用藥后視網膜組織以及血清中VEGF、PKCβ 的表達量不同程度下降，視網膜組織中occludin、claudin-5 水平上調，視網膜水腫得到不同程度緩解，以燈盞花素組最為明顯，說明燈盞花素可能通過下調VEGF、PKCβ 的表達水平，同時上調claudin-5、occludin 的表達以保護BBB。

綜上所述，燈盞花素可以通過影響VEGF、PKCβ的表達量以抑制新生血管的形成，保護BBB，改善視網膜水腫。 燈盞花素可增加微循環，改善血管通透性，調整PKCβ、VEGF 與緊密連接相關蛋白的平衡，是燈盞花素治療糖尿病視網膜水腫的作用機制之一，這對于今后深入研究糖尿病視網膜水腫打下堅實的基礎。 本實驗對象僅限于動物，而且關于糖尿病視網膜水腫的生成因素只考慮了PKC-VEGF通路的某些蛋白，實際上其發病機制繁雜，涉及多種通路及細胞因子，是多種因素相互作用的結果。燈盞花素對STZ 誘導的視網膜水腫及VEGF、PKCβ蛋白的調控具體機制亟待進一步深入研究。