藥品微生物限度檢查真菌污染鑒定溯源*

黃 結，李雪玲，朱 斌，甘永琦，王 濤，零文超

2020年版《中國藥典（四部）》［1］指導原則9203中規定，當藥品微生物檢驗結果不符合藥典各品種項下要求或另外建立的質量標準時，應調查原因?！端幤飞a質量管理規范》（GMP）第224 條規定，實驗室檢驗超標結果（OOS）需按操作規程進行完整地調查。進行OOS調查，找到微生物污染的根本原因，可為準確判定超標結果是否真實有效提供依據，利于檢測機構或企業有針對性地采取有效糾正和預防措施，避免同類事件再次發生，提高實驗室管理質量，同時為檢驗結果和產品風險作出準確判斷提供支撐［2］。微生物鑒定和溯源分析，對于確定微生物污染原因具有重要意義［3］。但截至目前，微生物溯源分型技術為無統一標準，不同分型方法各有其局限性［4］，其中內轉錄間隔區（ITS 序列）分析技術具有高通量、高效率、高準確率等特點，屬基因型鑒定技術，可實現微生物的鑒定、分類、溯源及污染調查分析［5］。本研究中以ITS 序列分析技術和基質輔助激光解離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術，對實驗室一次樣品真菌污染事件與OOS 調查采集到的環境相似菌株進行鑒定和溯源分析，為生產企業和檢測機構樣品污染真菌的溯源和控制提供依據和方法?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

GR110DR 型高壓蒸汽滅菌鍋（美國Zealway 公司）；AC2-6S1/A2級雙人操作生物安全柜（新加坡Esco公司）；BD720 型恒溫培養箱（德國Binder 公司）；MM400 型冷凍研磨儀（德國Retsch 公司）；JY300C 型電泳儀、JY -SPFT 型水平電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；5200 系列凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；U410 - 86 型超低溫冰箱（英國New Brunswick 公司）；DM6000B型顯微鏡（德國Leica公司）；Microflex LT型基質輔助激光解析飛行時間質譜儀（德國Bruker Daltonik GmbH公司）；Universal 320R型高速冷凍離心機（德國Hettich公司）；Mastercyler gradient PCR儀（德國Eppendorf公司）。

1.2 試劑

pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（批號為210310）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號為201112），均購自北京陸橋技術股份有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養基（德國Merck Millipore 公司，批號為VM906938）；乙腈、三氟乙酸（色譜純）、MALDI-TOFMS 基質、標準肽蛋白（德國Bruker Daltonik GmbH 公司）；聚合酶鏈式反應（PCR）引物（北京天根生化科技有限公司）；水為無菌水。

1.3 菌株來源

從藥品微生物限度檢查霉菌和酵母菌總數項目超標1次案例中，分離純化的樣品污染的主要霉菌標記為YP01 - YP04，OOS 調查采集到的相似環境菌標記為HJ01-HJ08。菌株來源見表1。

表1 菌株來源Tab.1 Origin of strains

1.4 菌株鑒定方法

傳統形態觀察法：無菌操作下接種各菌株于SDA平板上，23 ℃培養5 d，觀察菌落的顏色、形狀、大小、表面狀況、質地等形態特征，拍照并記錄。取適量培養物，封固液（乳酸品紅）制片，置顯微鏡油鏡下直接觀察。

ITS 序列分析法：采用北京天根生化科技有限公司DP350 天根植物基因組DNA 提取試劑盒（植物、真菌DNA提取均可使用）進行真菌DNA 的提取，具體操作參考說明書。PCR 擴增引物序列：ITS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3' ；ITS4，5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'。擴增體系為25 μL，其中10 × Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，引物（10 μmol/ L）1.5 μL，dNTP（10 mmol/ L）2 μL，Taq 酶（5 U/ μL）0.125 μL，DNA 5 μL，ddH2O 13.875 μL。擴增程序為，98 ℃，5 min；98 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃60 s（共35 個循環）；72 ℃10 min。得到的PCR 產物一部分用于凝膠電泳檢查，一部分進行ITS 序列測序，測序委托北京樂八科技有限公司完成。利用NCBI BLAST 工具將得到的菌株序列與Gen-Bank 基因庫中已知菌的序列進行比對，得到菌株鑒定結果。

1.4.3 MALDI - TOF - MS 鑒定法

采用甲酸乙腈提取法制備霉菌樣品［6］。取培養后菌株的菌絲體約10 mg，置離心管中，加入300 μL水，混勻，再加無水乙醇900 μL，混勻，13 000 r/ min 離心2 min，棄去上清液，室溫靜置2 min；待菌體完全干燥，加入70%甲酸溶液50 μL，混勻，室溫靜置2 min，加入乙腈50 μL，混勻，13 000 r/min離心2 min；取1 μL上清液滴加至MALDI 靶板上，室溫晾干，加1 μL HCCA 基質溶液，覆蓋晾干，將靶板置入MALDI-TOF-MS質譜儀中進行菌株鑒定。

2 結果

2.1 菌落形態與顯微形態

將樣品檢出的霉菌和采集到的環境霉菌同法培養后，取菌落形態相似的菌株一并進行鑒定溯源。樣品菌YP01 的菌落形態和顯微形態見圖1，各菌株的菌落形態和顯微形態描述見表2。

A. 菌落形態 B. 顯微形態圖1 菌株（YP01）的菌落形態與顯微形態A.Colony morphology B.Microscopic morphologyFig.1 Colony morphology and microscopic morphology of the strain（YP01）

表2 各菌株鑒定結果Tab.2 Results of strain identification

2.2 ITS 序列鑒定

凝膠電泳檢測結果顯示，12 個菌株的PCR 產物均在500～600 bp 之間得到清晰、完整的電泳條帶，詳見圖2。12個菌株的PCR產物鑒定結果最大鑒定率均大于99%（基因測序鑒定結果鑒定率大于98.7%，即與標準菌株序列同種［7-8］），表明結果可靠。ITS 序列鑒定結果見表2。

圖2 PCR產物的凝膠電泳檢測結果Fig.2 Results of gel electrophoresis detection of PCR products

2.3 MALDI-TOF-MS 鑒定

HJ02 - HJ08 的鑒定分值均大于2.0 分，表示鑒定結果準確，可鑒定出具體菌名。YP01-YP04 和HJ01 未給出具體鑒定結果，所測物質蛋白分子量主要集中在2 000～18 000 Da 范圍內（質譜圖見圖3），在橫坐標相同的點上有峰強度增強，各菌株主要質譜峰重疊度高。

圖3 菌株的疊加質譜圖Fig.3 Superimposed mass spectrograms of strains

2.4 同源性分析

利用MEGA 5.0 軟件對12 個菌株的序列進行比對，采用Neighborhood - Joining 法構建有根系統發育樹，結果見圖4。樣品菌YP01-YP04 和環境菌HJ01 的基因水平無明顯差異，能聚為一類，存在同源性。

圖4 菌株系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains

3 討論

在同一天實驗中出現多批樣品真菌結果超標，從超標樣品SDA 平板上觀察發現真菌形態非常相似，懷疑樣品受到了環境菌污染，觸發了實驗室OOS 調查。實驗員從人、機、料、法、環5個方面回顧整個檢驗流程，逐一排查原因，并使用SDA 接觸皿進行潔凈環境多地點采集和實驗用料的微生物檢測，共找到了8株與超標樣品相似的真菌。鑒定及同源性分析顯示，得出樣品檢出菌YP01 - YP04 和環境菌HJ01 存在同源性，即樣品污染菌來自pH 7.0 氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，是實驗用“料”出現問題。配制員再次針對同批次的實驗用料進行全面排查和回顧，其受污染的可能原因如下。一是使用的稀釋液經壓力蒸汽滅菌后存在有滅菌容器瓶的膠塞松動或容器傾倒現象，配制員操作是扭緊膠塞或扶正容器，繼續放入實驗室，稀釋液存在微生物污染風險；二是滅菌后的實驗材料未及時放入潔凈環境暫存室。針對以上原因實施如下糾正預防措施：1）重新換購一批匹配的膠塞；2）發現滅菌后容器膠塞有松動或容器傾倒，應立即丟棄；3）及時將滅菌物品移入潔凈環境暫存室。經過一段時間的驗證再無類似事件發生。

局限曲霉菌是人及動物曲霉病的病原菌，廣泛分布于土壤、食品和發霉紙盒及織物等，可通過呼吸道和血液傳播，可侵犯皮膚、黏膜、眼腦、耳鼻、肺部、胃腸道、神經系統和骨骼等，嚴重者可導致敗血癥。溫暖潮濕環境利于其生長和繁殖，可產生大量的分生孢子，易于煙霧化存在于空氣中，可通過實驗人員、物品傳遞和空氣流動污染實驗室潔凈區。針對實驗室潔凈區霉菌污染高風險點，加強清潔滅菌，定期采用過氧化氫殺孢子劑等進行徹底消殺，可確保潔凈區潔凈。

MALDI-TOF-MS 鑒定發現，局限曲霉菌的菌株蛋白質圖譜較佳，但MALDI-TOF-MS 的數據庫中缺少局限曲霉，未得到鑒定結果。同源性分析發現，YP01-YP04 和HJ01 的ITS 序列能聚為最小分支，質譜峰重疊度高，菌落形態和顯微形態相同，因此真菌YP01 -YP04和HJ01親緣關系非常接近。

ITS 序列鑒定分析結果發現，鑒定菌株序列與基因庫中的標準序列進行比對時會至少出現2 個匹配結果且最大鑒定率均為100%的情況，因此本研究中還結合了形態學觀察結果，以得到準確的鑒定結果［9］。霉菌的ITS 序列在結構和功能上具有高度保守性，是微生物核酸測序鑒定分類中得到廣泛應用的DNA 特征性核酸序列之一，方法易于標準化［10-11］。這也是本研究中采用ITS 序列分析技術進行霉菌污染溯源的原因，且該方法簡單、快速、重復性好。