富硒乳酸菌發酵葡萄汁工藝條件及功能性成分研究

翟碩莉王巖張秀豐

(1.衡水學院生命科學系，河北 衡水 053000；2.石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050000)

硒是人體必需且不能自身合成的微量元素，自然界的硒存在無機硒和有機硒2種形式，無機硒有毒性且人體難以吸收，有機硒如硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等毒性極低，人體可吸收利用[1]，且有研究表明，有機硒是谷胱甘肽過氧化酶的重要組成成分，一定量的硒攝入能夠促進生長、對視覺器官有重要作用[2]，硒還具有清除自由基、抗癌、提高免疫力等功效[3]。硒的適量攝入有益于人體健康，從食品中攝入有機硒是膳食硒的有效補充方式。

近年來，有多項報道稱通過微生物如酵母菌、乳酸菌可將食品中的無機硒轉化為有機硒，在保障食品安全的前提下，本研究選擇食品級乳酸菌進行發酵葡萄汁富集硒，通過對富硒乳酸菌發酵葡萄工藝條件的優化及發酵前后功能性物質的研究，評價乳酸菌發酵葡萄汁的多酚類物質、黃酮類物質及抗氧化活性，使硒元素與乳酸菌二者對人體的功效實現“1+1>2”的效果，以期研發一款集風味和功能性于一體的葡萄發酵制品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄、脫脂乳、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、白砂糖、食品級檸檬酸、沒食子酸標準品、蘆丁標準品、硝酸鋁、亞硝酸鈉、ABTS、鐵氰化鉀、果膠酶、福林酚試劑、硝酸、鐵氰化鉀等。

1.2 儀器與設備

培養箱、榨汁機、分光光度計、滅菌鍋、阿貝折光儀、pH計、原子熒光光譜儀、微波消解儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒乳酸菌的制備

脫脂乳中加入亞硒酸鈉(加入后濃度為0.8μg·L-1)，115℃，15min滅菌后，接入保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1)，42℃恒溫發酵至凝乳，即為富硒乳酸菌。

1.3.2 葡萄發酵工藝過程

巨峰葡萄→挑選、清洗→打漿→加入0.1%果膠酶酶解→8層紗布過濾→加輔料(白砂糖、檸檬酸)→均質→殺菌→冷卻后接種→發酵→成品。

1.3.3 單因素試驗和正交試驗

固定發酵溫度36℃，發酵時間12h，選取料水比3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3；加糖量3%、5%、7%、9%、11%；接種量1%、2%、3%、4%、5%，以發酵后pH值和感官評分為指標，以確定單因素的水平范圍。

根據單因素試驗得到的水平范圍，設計L9(33)正交試驗，見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.3.4 感官評價

評定小組成員為20名，男女各1/2人數，從3個方面進行感官評分，100分為滿分，取平均分，對不同發酵條件的乳酸菌發酵葡萄汁飲料進行感官評分，感官評分標準表見表2。

表2 葡萄汁感官評分標準表

1.3.5 測定指標

1.3.5.1 pH值

發酵后葡萄汁攪拌均勻，pH計測定。

1.3.5.2 可溶性固形物含量測定

使用阿貝折光儀測可溶性固形物，以°Brix表示。

1.3.5.3 總酚測定

采用Folin-Ciocalteu[4]法在765nm下，測定貯藏期樣品中的總酚。以沒食子酸為標準品，吸光值為縱坐標(Y)，沒食子酸濃度為橫坐標(X)建立標準曲線，得回歸方程：

Y=0.018X+0.0012，R2=0.9982

1.3.5.4 總黃酮測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法在510nm下，測定總黃酮含量[5]，以蘆丁為標準品，吸光值為縱坐標(Y)，蘆丁濃度為橫坐標(X)建立標準曲線，得回歸方程：

Y=0.0124X-0.0114

1.3.5.5 ABTS清除率測定[6]

配制7.4mmol·L-1ABTS，2.6mmol·L-1K2S2O8，等體積混合，避光室溫下靜置12h，即儲備液。使用時以無水乙醇稀釋，在734nm處使吸光值為0.7±0.02，即ABTS+工作液。

葡萄汁與ABTS+工作液反應，吸光值記為A1，葡萄汁與無水乙醇反應，吸光值記為A2，無水乙醇與ABTS+工作液反應，吸光值記為A0。

ABTS自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)/

A0]×100%

1.3.5.6 Fe3+還原力的測定

取0.2mL貯藏期葡萄汁，參考肖夢月等[7]的測定方法，在700nm處測各貯藏期葡萄汁的吸光值。

1.3.5.7 硒測定

采用GB 5009.93-2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》中的 第一法 氫化物原子熒光光譜法[8]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵葡萄汁工藝研究

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 料水比對發酵葡萄汁的影響

料水比決定著果汁中葡萄的使用量和發酵過程中乳酸菌提供的營養物質是否充足。從圖1結果看，料水比過低，味道過淡，口感不佳；料水比過高，葡萄汁太粘稠，評分較低。料水比從1∶3增加到3∶1，pH值呈先下降再上升趨勢，料水比2∶1時pH值稍高于1∶1，感官評分最高。

圖1 料水比對葡萄汁pH的影響

2.1.1.2 加糖量對發酵葡萄汁的影響

乳酸菌利用葡萄中的碳水化合物進行發酵，白砂糖的加入使得發酵過程中產生的酸被中和，產生適口的酸甜感。由圖2可知，加糖量3%～9%時，pH值逐漸降低，接種量11%時pH升高?？赡苁且驗楫敿犹橇窟^多時，乳酸菌不能將糖完全利用，導致pH升高。當加糖量為9%和11%時，感官評分較高，低于9%，口感偏酸。

圖2 加糖量對葡萄汁pH的影響

2.1.1.3 接種量對乳酸菌發酵山楂汁的影響

如圖3所示，隨乳酸菌接種量的增加，發酵過程中產生較多的有機酸，pH逐漸降低，當接種量高于3%后，pH回升，可能是發酵底物不足以提供足夠的營養，導致乳酸菌自溶。接種量為3%，感官評分最高。

圖3 接種量對葡萄汁pH的影響

2.1.2 正交試驗

由表3可知，當評價指標為感官評分，3個因素的主次影響順序為C>A>B，最佳工藝參數為A2B2C2；當評價指標為pH值，主次影響順序為A>C>B，最佳工藝參數為A2B3C3。從2個指標的數據分析結果看，加糖量對乳酸菌發酵葡萄汁工藝影響最小，從合理膳食的角度考慮，糖的攝入不宜過多，從口感角度考慮，接種量較大時酸度大，因此選擇加糖量7%，接種量3%較適宜，最終確定工藝條件為A2B2C2。

表3 L9(33)正交試驗表

2.1.3 驗證試驗

正交試驗數據分析得出的最佳工藝條件為A2B2C2，即料水比2∶1，加糖量7%，接種量3%，在此條件下發酵葡萄汁，進行驗證試驗，結果測定pH值4.08，感官評分88.3，與正交試驗表中的結果比較，pH值不是最低的，但感官評分最高，可能是糖酸比較適宜，因此可以選擇A2B2C2作為最佳工藝條件發酵葡萄汁。

2.2 乳酸菌發酵葡萄汁理化指標和功能性物質變化

葡萄中富含有機酸、糖類、酚類物質、黃酮類物質、維生素、礦物質等，發酵過程中，乳酸菌以這些營養成分為底物改善葡萄汁的風味和功能特性。從表4可知，發酵后的葡萄汁的pH值降低了0.36，可溶性固形物降低了1.43°Brix，這是由于發酵過程中乳酸菌利用糖類物質生成了有機酸，使得葡萄汁pH值降低，可溶性固形物含量減少。

表4 葡萄汁發酵前后指標的變化

試驗測得發酵后葡萄汁的總酚含量較發酵前增加了13.9%，總黃酮含量增加了18.2%。葡萄中含有的酚類物質以游離態和結合態2種形式存在，游離態酚被氧化導致總酚含量降低，酸性環境能夠減緩氧化過程，而乳酸菌在發酵過程中產生的酚酶轉化結合態酚，形成更多的游離態酚[9]。多酚類物質含量的增加能夠清除更多的自由基，使得ABTS自由基清除能力增加，鐵離子還原能力增強，加強了葡萄汁的抗氧化作用。葡萄汁中的硒含量從發酵前的0.07μg·mL-1增加到0.18μg·mL-1，說明發酵葡萄汁所用乳酸菌具有一定的富硒能力。

3 結論

本研究以食品級的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1)混菌發酵葡萄汁，對其發酵工藝條件及發酵前后功能性成分和抗氧化活性進行了分析，乳酸菌混菌發酵葡萄汁能夠提高總酚和總黃酮含量，從而達到一定的自由基清除能力和鐵離子還原能力，同時葡萄汁中有機硒的含量增加了0.11μg·mL-1，說明該發酵葡萄汁具有一定的富硒功能和抗氧化功能。