S100A4基因載體的構建及其在人胃癌細胞系中的表達

余海濤, 陳正徐, 謝揚虎, 張 飛

(1. 安徽醫科大學附屬合肥醫院 檢驗科, 安徽 合肥, 230041;2. 上海交通大學附屬新華醫院 普外科, 上海, 200092)

胃癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一。胃癌的主要治療方法是手術和輔助化療,但傳統化療副作用大,需要開發新的輔助治療方法。研究胃癌發生發展的分子生物學機制,尋找新的靶點,將有助于開發更有效的診斷和治療方法。近年來, S100蛋白家族越來越受到人們的關注,多個S100成員在腫瘤中表達異常,并與腫瘤的浸潤和轉移密切相關。文獻[1]報道, S100A2、S100A4、S100A6和S100A14與各種惡性腫瘤的發病和進展有關。S100A4蛋白是S100蛋白家族的成員,分子量約為11 kDa,由101個氨基酸組成。S100A4在許多人類腫瘤中都有表達,其表達與胃癌的侵襲和淋巴結轉移密切相關,但S100A4基因在胃癌中的作用機制尚不清楚。本研究擬通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)與基因重組技術構建重組真核表達載體pcDNA3.1-S100A4, 然后轉染胃癌細胞系MKN1, 本研究為進一步探討S100A4對胃癌細胞生物學功能的影響及其在胃癌發病中的作用奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃黏膜上皮細胞系GES-1、人胃癌細胞系MKN1(安徽醫科大學病理學研究室購買)、克隆載體pMD18-T simple Vector、限制性核酸內切酶、大腸桿菌JM109感受態細胞和膠回收純化試劑盒(均為Takara公司)、真核表達載體pcDNA 3.1(+)、LipofectamineTM2000脂質體、TRIZOL Reagent(均為Invitrogen公司)、反轉錄試劑盒(Promega公司)、PCRKit (TIANGEN公司)、質粒提取試劑盒(QIAgen公司)、RPMI1640培養基、胎牛血清(GIBCO 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養: 在37 ℃、5% CO2飽和濕度下,在RPMI1640培養基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中培養GES-1和MKN1細胞, 0.25%胰蛋白酶(用生理鹽水配制)消化傳代。

1.2.2 總RNA的提取: 提取GES-1細胞(細胞數約2×106個)總RNA。① 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次,加入1 mL TRIZOL試劑; ② 室溫靜置5 min, 加樣槍吹打混勻,取1.5 mL Eppendorf管收集; ③ 加入0.2 mL氯仿,渦旋振蕩15 s, 室溫靜置2～3 min; ④ 4 ℃, 12 000轉/min離心15 min, 將上清液轉入另一支新試管; ⑤ 加入0.5 mL異丙醇,混勻,室溫靜置10 min; ⑥ 4 ℃, 12 000轉/min離心10 min, 棄上清; ⑦ 加1 mL 75%乙醇(DEPC水配制),渦旋沖洗1次; ⑧ 4 ℃, 7 500轉/min離心5 min, 棄上清; ⑨ 風干15 min, 將沉淀物溶于0.01% DEPC-H2O中,取少量進行含量和純度檢測,剩余部分保存于-70 ℃冰箱中。

1.2.3 cDNA的合成: 采用Promega逆轉錄試劑盒,將總RNA逆轉錄到cDNA第一鏈上。總反應體積為20 μL, 反應體系見表1。

表1 cDNA合成反應體系

1.2.4 PCR 擴增: 參照GenBank人S100A4基因cDNA序列(基因登錄號: NM_011311), 使用Primer 3.0軟件設計引物,以轉逆錄合成的cDNA作為模板進行PCR 擴增,擴增片段長度327 bp。所用的引物序列如下: 5′-CCCAAGCTTGTCATGGCGTGCCCT -3′; 5′-CGCGGATCCTCATTTCTTCCTGGGCT -3′。PCR反應體系見表2。

表2 PCR擴增反應體系

PCR反應條件:

PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳證實,用凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。

1.2.5 pMD18-T simple-S100A4構建: 載體連接,反應體系(混勻, 16 ℃過夜,用于轉化)見表3。

表3 PCR擴增反應體系

① 轉化: 將6 μL連接產物加入60 μL的 JM 109感受態大腸桿菌中,輕輕混勻,置于冰上30 min。42 ℃熱休克55 s,立即置于冰上,加入940 μL LB培養基, 37 ℃ 150轉/min孵育1 h, 取200 μL涂布于LB瓊脂平板(含50 μg/mL 氨芐青霉素紙片, X-Gal, IPTG)上, 37 ℃培養過夜,篩選藍白陽性克隆。② 富集測序: 挑取數個白色單菌落,接種于5 mL LB培養基中, 37 ℃ 孵育12～16 h。以2 μL菌液為模板進行PCR擴增,篩選出陽性克隆,送1 mL菌液至金域檢驗公司測序。③ 質粒提取: 取2 mL菌懸液轉移至Eppendorf管中, 10 000轉/min離心2 min, 棄去上清液,用質粒提取試劑盒提取質粒。取少量用于內容物純度檢測,其余在-20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.6 pcDNA3.1-S100A4的構建: 重組質粒pMD18- T simple-S100A4以BamH Ⅰ/Hind Ⅲ 雙酶切,反應體系見表4。

表4 PCR擴增反應體系

37 ℃過夜,加入1 μL緩沖液終止反應,放入1.2%瓊脂糖凝膠電泳,回收純化目的片段,與BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切的真核表達載體PCDNA3.1(+)連接, 16 ℃水浴循環過夜,轉化JM109感受態細胞,鋪勻所有轉化液,篩選出重組克隆,提取質粒,酶切鑒定。見圖1。

圖1 pcDNA3.1(+)載體質粒譜

1.2.7 細胞的轉染: ① 將MKN1細胞按2×105個/孔接種于1.5 mL/孔無抗生素培養皿中, 37 ℃過夜培養; ② 將4 μg質粒 (pcDNA3.1-S100A4/pcDNA3.1-empty)和8 μL Lipofectamin2000在無血清和無抗生素的培養基中稀釋至250 μL室溫5 min; ③ 用質粒(pcDNA3.1-S100A4/pcDNA3.1-empty)轉染MKN1細胞,將質粒與Lipofectamin2000稀釋液混合, 30 min室溫孵育,將500 μL混合物加入培養皿中,前后輕輕混勻; ④ 6 h后換培養液,根據增殖情況傳代,收集不同時間的細胞。

1.2.8 RT-PCR檢測S100A4基因轉錄水平的表達: 轉染后總RNA提取及cDNA第一鏈合成步驟同上。運用Primer 3.0 軟件設計引物,β-actin為內參對照。所用引物序列如下:S100A4: 上游引物5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′; 下游引物5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′;β-actin: 上游引物5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′; 下游引物5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。反應體系同前述; 反應條件:

2 結 果

2.1 RT-PCR擴增S100A4基因片段

RT-PCR擴增的產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳,可見預期的327 bp基因片段,見圖2。

M: DL2000標記; 1: RT-PCR擴增S100A4基因。圖2 S100A4基因RT-PCR擴增結果

2.2 S100A4基因的序列測定

PCR產物連接克隆載體的測序與GenBank公布序列一致,無突變(見圖3)。

圖3 pMD18-T simple-S100A4重組載體測序結果

2.3 pcDNA3.1-S100A4表達載體的構建

構建的pcDNA3.1-S100A4載體經Hind Ⅲ/BamH Ⅰ雙酶切鑒定結果見圖4。以上結果可以證實真核表達載體pcDNA3.1-S100A4構建成功。

M: DL2000標記; 1: pcDNA3.1-S100A4; 2: pcDNA3.1-S100A4載體的雙酶切。圖4 pcDNA3.1-S100A4載體的雙酶切

2.4 pcDNA3.1-S100A4表達載體的鑒定

在胃癌細胞系MKN1中轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體,以轉染pcDNA3.1空載體和正常未轉染的MKN1細胞作為對照。結果表明轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體48 h后,S100A4mRNA表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.01), 見圖5。

M: DL2000標記; 1: 未轉染的正常MKN1細胞; 2: 轉染pcDNA3.1 -陰性對照; 3: 轉染pcDNA3.1-S100A4。圖5 轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體的S100A4表達

3 討 論

S100蛋白首先在牛腦組織中發現,這是一組小分子量的酸性蛋白質,是鈣結合蛋白中最大的亞類[2-3]。在21個S100基因家族成員中,其中有15個位于染色體lq21上,其結構在進化過程中是保守的。該段染色體不穩定,易發生多染色體重組,如雜合性丟失、易位、重疊等,與免疫調節和腫瘤預后密切相關[4]。此外,這15個S100家族成員參與了表皮分化復合物(EDC)的形成,該復合物與上皮分化與腫瘤的形成密切相關[5]。

S100A4蛋白作為S100蛋白家族的一員,在小鼠的轉染癌基因v-K-ras和v-Ha-ras的正常細胞和成纖維瘤細胞中, S100A4在蛋白水平和mRNA水平異常高表達[6]。 S100A4在許多人類腫瘤中均有表達,研究[7]發現S100A4在大多數早期和晚期乳腺癌組織的細胞膜、細胞質和細胞核中均有表達,因此推測S100A4可能在乳腺癌的發生發展中起作用。研究[8]證明, S100A4在正常胰腺組織、胰腺良性病變和胰腺癌組織中的表達各不相同,在胰腺癌組織中的表達水平最高。RT-PCR檢測發現,有95%的胰腺癌細胞S100A4呈過表達,免疫組化分析證實S100A4蛋白在胃癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中高表達[9-10]。

目前,基因研究的熱點不僅包括序列結構,還包括表達調控和功能。分子克隆中常用的攜帶外源基因的載體主要包括: 病毒類與非病毒類的真核表達載體[11]。本研究通過RT-PCR獲得全長S100A4基因。DNA測序結果表明,該基因產物序列與GenBank中S100A4的編碼序列完全吻合。采用基因重組技術將S100A4基因插入pcDNA3.1載體中,構建真核表達載體pcDNA3.1-S100A4。雙酶切鑒定證實目的基因片段插入到載體的相應位置,證明重組質粒pcDNA3.1-S100A4構建成功。其構建有助于通過細胞轉染手段,將S100A4導入細胞內,讓S100A4在胃癌細胞中高度表達,為了更深入研究S100A4蛋白對胃癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響奠定了基礎。

本研究中,在胃癌細胞系MKN1中轉染cDNA3.1-S100A4表達載體,以轉染pcDNA3.1空載體和正常未轉染的MKN1細胞作為對照。結果顯示, pcDNA3.1-S100A4表達載體轉染后48 h,S100A4mRNA的表達水平顯著增加,表明構建的質粒轉染到細胞中并成功表達。本研究探討了S100A4基因在胃癌細胞中的表達,為進一步探索S100A4基因能否作為胃癌診斷和治療的靶點奠定了實驗基礎。