環指蛋白44基因表達對胃癌細胞增殖和凋亡的調節作用及機制

師 文, 高 楠, 孫煥煥, 韓 煒

(1. 西安交通大學第一附屬醫院 消化內科, 陜西 西安, 710061;2. 陜西省人民醫院 腫瘤外科, 陜西 西安, 710068)

胃癌是世界上最常見的消化系統惡性腫瘤之一, 2020年全球新增確診病例超過10萬例,發病率位于惡性腫瘤第5位[1]。胃癌早期缺乏特異性癥狀,診斷存在困難,多數患者確診后易錯過最佳治療時機,治療后5年生存率也不足20%[2], 病死率在所有惡性腫瘤中位居第4位[3-4]。近年來胃癌的發病率和病死率逐年下降, 2022年新增胃癌病例51萬,死亡病例40萬[5]。胃癌發病機制涉及多種因素、發育過程中的多個步驟以及多重基因突變和異常[6-7]。E3泛素連接酶家族在各種惡性腫瘤的發生、發展以及耐藥中發揮重要作用。環指蛋白44(RNF44)是一種新發現的E3泛素連接酶,參與黑色素瘤、口腔鱗狀細胞癌和膠質瘤等發生和發展[8-10]。目前,RNF44基因作用的分子機制及其與胃癌進展的關系仍有待進一步探索。本研究采用細胞生物學和動物實驗等方法探討RNF44基因對胃癌發生、發展的影響和機制,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株來源: 細胞株AGS、MGC-803、MKN28、MKN45及正常胃黏膜GES-1細胞源自ATCC細胞庫。

1.1.2 實驗動物: 無特定病原體(SPF)級雄性裸鼠12只,體質量18～20 g, 購自上海斯萊克實驗動物有限公司,動物合格證編號為20170005034573, 適應性飼養1周后開始造模。

1.1.3 主要試劑: 胎牛血清(美國Gibco公司), RPMI-1640培養液(美國Hyclone公司),青鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司), CCK-8試劑(美國Signalway antibody 公司), Trizol試劑、LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司),逆轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司), SYBR Green PCR試劑盒(美國Thermo公司), RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Tris-HCl電泳緩沖液、蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司), RNF44一抗(美國NOVUS公司), Ki-67、AKT、P-AKT(美國Abcam公司), GAPDH一抗(美國Proteintech公司), Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、HRP標記二抗、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)、4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和防淬滅封片劑(上海碧云天公司)。shRNF44病毒及對應空載病毒shNC、oeRNF44病毒及對應空載病毒Vector(本實驗構建)。RNF44和GAPDH引物序列和產物長度見表1。

表1 引物序列和產物長度

1.1.4 主要儀器: Forma 3111型CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司), DHG-9023A型恒溫烘箱(上海恒一科學儀器有限公司), TDZ4-WS型離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司), TG-16M型低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司), K30型旋渦振蕩器(上海青浦瀘西儀器廠), PRO200型電動勻漿機(上海弗魯克科技發展有限公司), CytoFLEX型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司), ABI-7300型Real-time檢測儀(美國ABI公司), DNM-9602型酶標儀(北京普朗新技術有限公司), XDS-500C型顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司), ECLIPSE Ni型熒光顯微鏡(日本NIKON公司), SQ2125型石蠟切片機和PPTHK-21B型攤片機(湖北徠克醫療儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和傳代: 胃癌細胞株AGS、MGC-803、MKN28、MKN45及正常胃黏膜GES-1細胞復蘇后,采用含10%胎牛血清、1%雙抗(青鏈霉素混合液)的RPMI-1640培養液于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中進行培養, 24 h更換1次培養液,待細胞生長至80%～90%時進行傳代。加入0.25%胰蛋白酶液消化細胞1～2 min, 顯微鏡下觀察細胞變圓即可加入新鮮培養液終止消化, 1 000 轉/min室溫離心5 min, 加入適量新鮮培養液反復輕輕吹打,使細胞分散成單細胞懸液,另取培養瓶,將單細胞懸液加入培養瓶中繼續培養進行后續實驗。采用定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)和Western blot檢測各細胞中RNF44的基因和蛋白表達。

1.2.2RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株的構建: 收集處于對數生長期的MKN45細胞,按照每孔5×105的密度鋪入6孔培養板中,分為Control組、shNC組和shRNF44組。每孔中加入2 mL完全培養基,放入37 ℃、5%CO2培養箱內培養,細胞生長至70%左右進行慢病毒轉染。Control組每孔加入2 mL完全培養基,其余各組每孔分別加入siNC和shRNF44各5 μL以及1 μL聚凝胺(5 μg/μL), 于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h, 然后更換為完全培養基繼續培養72 h, 采用Q-PCR和Western blot檢測RNF44 的基因和蛋白表達效率,確認RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株是否構建成功。

1.2.3RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株增殖、凋亡和AKT信號蛋白的測定: 按1.2.2方法構建RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株,各組細胞轉染24 h, 更換為完全培養基,繼續進行培養,采用CCK-8測定細胞增殖情況,采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況,采用Western blot檢測RNF44、AKT和p-AKT蛋白的表達。

1.2.4RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株的構建: 收集處于對數生長期的AGS細胞,按照5×105個/孔的密度鋪入6孔培養板中,分為Control組、Vector組和oeRNF44組,每孔中加入2 mL培養基,放入37 ℃、5%CO2培養箱內培養,細胞生長至70%左右進行慢病毒轉染。Control組每孔加入2 mL完全培養基,其余各組每孔分別加入Vector和oeRNF44各5 μL以及1 μL 聚凝胺(5 μg/μL), 于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h, 然后更換為完全培養基繼續培養72 h。采用Q-PCR和Western blot檢測RNF44 的基因和蛋白表達效率,確認RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株是否構建成功。

1.2.5RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株增殖、凋亡和AKT信號蛋白的測定: 按1.2.2方法構建RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株,各組細胞轉染后24 h, 更換為完全培養基,繼續進行培養,采用CCK-8測定細胞增殖情況,采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況,采用Western blot檢測RNF44、AKT和p-AKT蛋白的表達。

1.2.6 AKT通路抑制劑LY294002對RNF44基因過表達AGS細胞株增殖、凋亡和AKT信號蛋白影響的測定: 按1.2.2方法構建RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株,各組細胞轉染后24 h, 更換為分別含AKT通路抑制劑LY294002(20 μmol/L)或溶媒(Vehicle)完全培養基,繼續進行培養,采用CCK-8測定細胞增殖情況,采用Q-PCR和Western blot檢測相關蛋白表達效率。

1.2.7 MKN45細胞株構建的裸鼠皮下瘤模型實驗: 12只裸鼠隨機分為shNC組(n=6)和shRNF44組(n=6)。各組裸鼠酒精棉球消毒,shNC組裸鼠于腋下皮下接種MKN45細胞100 μL(2×106個), shRNF44組裸鼠于腋下皮下接種RNF44干擾后的MKN45細胞100 μL(2×106個)。接種后將不同組別的裸鼠分籠飼養,定期喂水和飼料,定期更換墊料。待注射細胞1周后,每3 d游標卡尺測量腫瘤大小。接種33 d時處死,取出腫瘤組織稱重并拍照,將腫瘤組織分為2個部分,分別進行免疫熒光染色實驗和Western blot實驗。免疫熒光染色實驗: 將腫瘤組織置于10%福爾馬林中固定48 h, 流動沖洗后,采用梯度濃度乙醇(50%→70%→85%→95%→100%)進行退水,脫水后經二甲苯透明(2 h×2次)、浸蠟、包埋、常規切片、烤片,二甲苯脫蠟,采用梯度濃度乙醇(100%→95%→85%→75%)進行水化,經檸檬酸鈉緩沖溶液高壓修復,滴加一抗于4 ℃孵育過夜,滴加二抗,室溫孵育1 h, 加入經DAPI稀釋后的防淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍片(放大倍數400倍)。另一部分于-20 ℃凍存,后續采用Western blot檢測腫瘤組織RNF44、AKT、p-AKT蛋白的表達。

1.2.8 CCK-8檢測細胞增殖實驗: 各組細胞慢病毒轉染后更換為完全培養基,調整細胞懸液濃度(1×104個/mL), 于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中進行培養,分別在0、12、24、48、72 h后,加入CCK-8試劑繼續培養1 h, 用酶標儀測定450 nm波長吸光度,計算各組細胞的增殖率。

1.2.9 流式檢測細胞凋亡實驗: 各組細胞慢病毒轉染后更換為完全培養基,調整細胞懸液濃度(1×104個/mL), 于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養72 h, 以預冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍,離心(1 000 g×5 min)、棄上清,收集細胞,用PBS輕輕重懸細胞并計數。取5×104個重懸細胞,離心(1 000 g×5 min), 棄上清,加入195 μL結合緩沖液重懸細胞,分別加入Annexin V-FITC 10 μL和碘化丙啶(PI) 5 μL進行染色,避光室溫孵育15 min, 置于冰浴,用流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.2.10 Q-PCR實驗: 各組細胞慢病毒轉染后更換為完全培養基,調整細胞懸液濃度(1×104個/mL), 于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養72 h, 用PBS 清洗細胞后采用TRIzol試劑提取RNA。采用酶標儀檢測260 nm和280 nm處的吸光度值(OD260 nm/OD280 nm: 1.8～2.0)。參照逆轉錄試劑盒說明書,將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件為: 37 ℃, 15 min; 85 ℃, 5 s; 4 ℃ 10 min。取cDNA 2 μL、上游及下游引物各1 μL、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL和滅菌水8.5 μL組成的反應體系,按照SYBR Green qPCR 試劑盒說明書進行qRT-PCR。PCR條件: 95 ℃變性15 s, 60 ℃ 退火60 s, 72 ℃ 60 s, 共40 個循環, 72 ℃延展5 min。以GAPDH作為內參,采用2-△△Ct法計算RNF44mRNA的相對表達量。

1.2.11 Western blot實驗: 各組細胞慢病毒轉染后更換為完全培養基,調整細胞懸液濃度(1×104個/mL), 于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養72 h, 加入RIPA裂解液冰上裂解,離心,收集上清液。BCA法進行蛋白定量,于-20℃保存。將蛋白樣品于恒溫水浴鍋中煮沸5 min 變性。取蛋白上清液50 μg于SDS-PAGE凝膠恒壓(120 V)電泳2 h, 轉移至PVDF膜(0.3 A×2 h), 于3%脫脂奶粉中室溫封閉2 h, TBST溶液洗膜(10 min/次×3次),分別滴加一抗溶液p-Cdc2、Cdc2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K、p-MTOR、MTOR及GAPDH孵育,于4 ℃過夜, TBST溶液洗膜(10 min/次×3次),再與相應二抗室溫孵育1 h。TBST溶液洗膜(10 min/次×3次),用ECL plus試劑發色液顯色,化學發光信號采用ChemiDoc MP凝膠成像系統檢測。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。各組數據以均值±標準差表示,數據采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同胃癌細胞株RNF44 的基因和蛋白的

表達水平

不同胃癌細胞株RNF44的基因和蛋白的表達水平不同, RNF44 的基因和蛋白的表達水平呈正相關(r=0.994,P<0.05), 其中GES-1細胞株RNF44的基因和蛋白表達水平最低, MKN45細胞株RNF44的基因和蛋白表達水平最高,見圖1、圖2。

2.2 RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株的構建

MKN45細胞株經RNF44基因干擾慢病毒轉染后, RNF44的基因和蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05), 而空白對照組(Control組)與空載組(shNC組)細胞RNF44的基因和蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05), 說明RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株的構建成功,見圖3、圖4。

圖1 不同胃癌細胞株RNF44基因表達水平(n=6)

2.3 RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株的構建

AGS細胞株經RNF44基因過表達慢病毒轉染后(oeRNF44組), RNF44的基因和蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05), 而空白對照組(Control組)與空載組(Vector組)細胞RNF44的基因和蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05), 表明RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株的構建成功,見圖5、圖6。

2.4 RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株增殖、細胞凋亡和AKT信號通路蛋白的表達

RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株增殖培養48、72h增殖能力降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖7; 培養72 h時,細胞早期和晚期凋亡率均增加,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖8;RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株RNF44和p-AKT蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05), 而AKT蛋白表達無顯著變化(P>0.05), 見圖9。

圖2 不同胃癌細胞株RNF44蛋白表達水平(n=6)

與shNC組比較, ?P<0.05。圖3 RNF44基因慢病毒轉染MKN45細胞株后RNF44基因的表達(n=6)

2.5 RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株增殖、細胞凋亡和AKT信號通路蛋白的表達

RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株增殖培養48、72 h增殖能力增加,差異有統計學意義(P<0.05),見圖10; 培養72 h時,細胞早期和晚期凋亡率均降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖11; 培養72 h時,RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株RNF44和p-AKT蛋白表達水平增加,差異有統計學意義(P<0.05), 而AKT蛋白表達無顯著變化(P>0.05), 見圖12。

2.6 AKT通路抑制劑對RNF44基因過表達AGS細胞株增殖、凋亡和相關信號通路的影響

AKT抑制劑(LY294002)可使正常AGS細胞或RNF44基因過表達AGS細胞株增殖能力降低,細胞早期和晚期凋亡率均升高, p-AKT蛋白表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05), 而AKT蛋白表達無顯著變化(P>0.05), 見圖13、圖14、圖15。

與shNC組比較, ?P<0.05。圖4 RNF44基因慢病毒轉染MKN45細胞株后RNF44蛋白的表達(n=6)

與Vector組比較, ?P<0.05。圖5 RNF44基因過表達慢病毒轉染MKN45細胞株后RNF44基因的表達(n=6)

2.7 MKN45細胞株構建的裸鼠皮下瘤模型實驗

實驗結束時, shRNF44 組裸鼠腫瘤組織大小和質量均較shNC組降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖16; 免疫熒光染色結果顯示, shRNF44 組裸鼠腫瘤組織Ki-67表達較shNC組降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖17; Western blot檢測結果顯示, shRNF44 組裸鼠腫瘤組織RNF44和p-AKT蛋白表達較shNC組降低,差異有統計學意義(P<0.05), 2組裸鼠腫瘤組織AKT蛋白表達基本一致,見圖18。

3 討 論

針對胃癌的治療手段包括手術切除、化療以及放療等[11]。目前,手術被認為是唯一的根治性治療方法。盡管胃癌的治療已取得較好的進展,但因其存在確診晚、復發、化療副作用和耐藥等問題,導致整體治療效果不理想[12]。研究開發預防胃癌復發和轉移的治療手段也成為了推動癌癥治療的重大挑戰[13]。因此,深入分析胃癌發生、發展的分子機制,尋找新的治療靶點,不斷開發新的治療方案,對提高胃癌患者的生存率極為重要[14-15]。

與Vector組比較, ?P<0.05。圖6 RNF44基因過表達慢病毒轉染MKN45細胞株后RNF44蛋白的表達(n=6)

泛素作為一種在真核生物中普遍存在的小分子調節蛋白,可在翻譯后水平修飾底物蛋白,參與細胞的增殖、分化、凋亡及DNA修復等生理活動的調控[16], 其介導的底物傳遞過程需要泛素激活酶E1、泛素結合酶E2及泛素連接酶E3的共同參與[17]。泛素連接酶E3可被分為RING家族、HECT家族及RBR家族,其中RING家族成員眾多,是最大的泛素連接酶家族, RING家族中RNF2、RNF6、RNF43、RNF128、RNF180與胃癌的發生、發展或臨床預后相關。ZHANG J F等[18]研究顯示,胃癌細胞中RNF2mRNA和其蛋白水平明顯增加,敲除RNF2 可抑制胃癌細胞的活力并誘導G1期細胞周期停滯,并上調細胞周期相關基因p21和p27的mRNA及其蛋白水平。RNF6在胃癌組織中表達水平均有增高,還可促進胃癌細胞的增殖[19]。RNF43在胃癌組織高表達,并且RNF43高表達與患者發生遠處轉移、淋巴結轉移和總生存期顯著縮短相關,因此成為胃癌侵襲、轉移和不良預后的原因之一[20]。路德榮等[21]研究發現, RNF128低表達的胃癌患者總生存期、首次進展生存期、無進展生存期低于RNF128高表達患者,并且細胞實驗證明RNF128通過泛素化穩定Axin1蛋白抑制胃癌的發生發展。另外, RNF180可抑制胃癌細胞的生長、增殖能力,促進胃癌細胞凋亡[22]。RNF44是由LI Y Y等[8]于2017年發現的一種新的E3泛素連接酶,該蛋白負責BRAF抑制劑耐藥黑色素瘤細胞中AMPK-β1的降解,并且ERK/AKT過度激活誘導轉錄因子CREB而導致RNF44表達上調。LUO F F等[9]研究發現,口腔鱗狀細胞癌組織和SCC-9細胞中RNF44的表達上調,特別在SCC-9耐藥細胞中表達更高,降低RNF44表達可通過下調miR-125a-5p而逆轉SCC-9耐藥細胞對順鉑耐藥性和細胞糖酵解作用。

與shNC組(空載組)比較, ?P<0.05。圖7 RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞株增殖情況(n=6)

與shNC組(空載組)比較, ?P<0.05。圖8 RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞凋亡情況(n=6)

與shNC組比較, ?P<0.05。圖9 RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞RNF44、AKT和p-AKT蛋白情況(n=6)

本研究結果顯示,胃癌AGS、MGC-803、MKN28、MKN45細胞株以及正常胃黏膜GES-1細胞中RNF44的基因和蛋白表達水平不同,其中GES-1細胞株RNF44的基因和蛋白表達水平最低, MKN45細胞株RNF44的基因和蛋白表達水平最高,說明RNF44可能參與胃癌細胞的發生和發展。細胞的異常增殖是惡性腫瘤最重要的特征之一,細胞實驗結果顯示, MKN45細胞株經RNF44基因干擾慢病毒轉染后, RNF44的基因和蛋白表達水平顯著降低,同時培養48、72 h時細胞增殖能力顯著降低(P<0.05), AGS細胞株經RNF44基因過表達慢病毒轉染后, RNF44的基因和蛋白表達水平顯著升高,同時培養48、72 h時細胞增殖能力顯著增加,并且加入AKT抑制劑可抑制細胞增殖能力,說明RNF44可顯著調節胃癌細胞的增殖作用。在裸鼠實驗中,shRNF44 組裸鼠腫瘤組織大小和質量均較shNC組顯著降低, Ki-67表達較shNC組顯著降低,進一步證實RNF44可抑制胃癌的生長。腫瘤的產生是因細胞增殖和死亡失衡導致,其中細胞凋亡受到抑制是非常重要的原因。本研究中, MKN45細胞株經RNF44基因干擾慢病毒轉染后,細胞早期和晚期凋亡率顯著升高(P<0.05), AGS細胞株經RNF44基因過表達慢病毒轉染后,細胞早期和晚期凋亡率顯著降低,并且加入AKT抑制劑可促進細胞凋亡,說明RNF44可顯著調節胃癌細胞的凋亡作用。

與Vector組(空載組)比較, ?P<0.05。圖10 RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株增殖情況(n=6)

與Vector組(空載組)比較, ?P<0.05。圖11 RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞凋亡情況(n=6)

與空載組(Vector組)比較, ?P<0.05。圖12 RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞RNF44、AKT和p-AKT蛋白情況(n=6)

與Vehicle組(溶媒組)比較, ?P<0.05。圖13 AKT通路抑制劑對正常AGS細胞株(A: Vector)和RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株(B: oeRNF44)增殖影響的測定結果(n=6)

與Vehicle組(溶媒組)比較, ?P<0.05。圖14 AKT通路抑制劑對正常AGS細胞株(A: Vector)和RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株(B: oeRNF44)凋亡影響的測定結果(n=6)

與Vehicle組(溶媒組)比較, ?P<0.05。圖15 AKT通路抑制劑對正常AGS細胞株(Vector)和RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株(oeRNF44)AKT和p-AKT蛋白表達影響的測定結果(n=6)

A: 2組裸鼠實驗結束時剝離的腫瘤組織; B: 2組裸鼠腫瘤組織體積,與shRNF44組比較, ?P<0.05; C: 2組裸鼠腫瘤組織質量,與shNC組比較, ?P<0.05。圖16 shRNF44組與shNC組裸鼠腫瘤組織大小和質量比較(n=6)

圖17 2組裸鼠腫瘤組織切片組織免疫熒光實驗結果(n=6, 放大400倍)

與shNC組比較, ?P<0.05。圖18 2組裸鼠腫瘤組織Western blot測定結果(n=6)

AKT作為調節蛋白在細胞存活和凋亡中起重要作用, AKT常穿梭于胞漿和核質之間,并不可能通過細胞受體直接激活,需要細胞受體先激活,然后發生磷酸化形成p-AKT, 釋放具有催化活性的亞基而激活AKT[23], 隨后激活Caspase-3、mToR等多條信號通路,從而控制細胞存活、增殖、DNA修復和合成代謝等過程。此外, p-AKT可通過調節Bcl-2蛋白家族來控制細胞凋亡[24]。本研究結果顯示,RNF44基因干擾慢病毒轉染MKN45細胞p-AKT表達顯著降低,而RNF44基因過表達慢病毒轉染AGS細胞株p-AKT表達顯著升高,這可能與RNF44調節細胞增殖和凋亡相關。此外,裸鼠試驗中shRNF44 組裸鼠腫瘤組織中p-AKT蛋白表達均較shNC組顯著降低,進一步證明RNF44可能通過調控p-AKT的表達來調節腫瘤生長。

綜上所述,RNF44基因表達對胃癌細胞增殖和凋亡有調節作用,RNF44過表達可顯著抑制腫瘤細胞增殖并促進凋亡,RNF44低表達可顯著促進腫瘤細胞增殖并抑制凋亡,RNF44可能通過調控p-AKT蛋白表達而發揮調節作用。