自然生境下蘆葦細胞中的未折疊蛋白反應

蘭 馨

首都師范大學生命科學學院，北京 100048

1 緒論

1.1 蘆葦簡介

1.1.1 蘆葦

蘆葦是禾本科多年生水生植物，隸屬于禾本目禾本科的蘆竹亞科蘆葦屬，在世界各大洲內分布廣泛。蘆葦倍性十分復雜，生態型眾多，遺傳資源豐富，具有很強的研究和應用價值。

1.1.2 蘆葦生態型

蘆葦的營養繁殖能力極強，是典型的無性系植物。其生態幅極廣，可在各種淺水濕地中形成密集的單優群落，甚至有些品種的蘆葦在荒漠和鹽堿地也能廣泛生存[1]。因此，蘆葦是研究倍性、基因表達和植物性狀的理想模式物種。

1.1.3 蘆葦品種化

根據《中國植物志》記載，蘆葦廣布在南北半球的溫帶地區，是蘆葦屬中分布最為廣泛的物種，并且其染色體倍性復雜，表型和遺傳多態性高。但蘆葦種內不同株系之間的分類關系并不清楚，無法表征其多樣的表型[2]。蘆葦品種化鑒定是蘆葦研究中十分重要的一個環節，運用簡便、快速的鑒定方法鑒定出植株的品種，可以大大減少工作量，降低成本，加快研究進程，對蘆葦研究具有重要意義。

1.2 LEA 研究現狀

1.2.1 LEA 起源

Dure 等[3]在棉花胚胎子葉中分離得到一組高表達的mRNA，將其命名為lea mRNA，同時獲取了其表達蛋白。該蛋白在棉花種子成熟后期大量積累，同時保護組織細胞在種子成熟過程中不被脫水脅迫傷害，于是該蛋白被命名為胚胎發育晚期豐富蛋白（LEA 蛋白）。當植物正常生長發育時，LEA 蛋白在種子發育晚期大量積累；當植物受逆境脅迫時，LEA基因也可以在其他組織中表達，從而增強植物的抗逆能力。

1.2.2 LEA 蛋白分類

LEA 蛋白在植物中廣泛存在。隨著關于LEA 蛋白的研究越來越多，LEA 蛋白的分類標準也發生變化。目前一般將LEA 蛋白家族分為8 個亞家族，即LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、LEA_6/PvLEA18、脫水素（DHN）和種子成熟蛋白（SMP）[4]。隨著基因組測序技術的日益成熟，多個物種的LEA基因家族已在全基因組水平上進行了分析鑒定，如在擬南芥中鑒定到51 個LEA 基因[3]，小麥中鑒定到179 個LEA 基因[5]，高粱中鑒定到35 個LEA 基因，玉米中鑒定到83 個LEA 基因[3]，大白菜中鑒定到65 個LEA 基因[6]。

1.2.3 蘆葦LEA 基因家族研究現狀

張茜[2]通過擬南芥中51 個LEA 基因的蛋白序列，在實驗室自建的三個蘆葦蛋白庫，即蘆葦融合蛋白庫（All，A）、沼澤蘆葦蛋白庫（SR，S）和沙丘蘆葦蛋白庫（DR，D）中進行搜庫，運用極大似然法（Maximum likelihood，ML）構建系統進化樹，將蘆葦LEA 蛋白序列分為7 簇，分別是LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、Dehydrin、SMP 和PvLEA18（LEA_6）。

1.2.4 LEA 基因

在蘆葦基因組中篩選出136 個LEA 基因家族成員，其中LEA_1 亞組中有4 個成員，LEA_2 亞組中有104 個成員，LEA_3 亞組中有9 個成員，LEA_4亞組有3 個成員，LEA_5 亞組中有2 個成員，DHN亞組中有8 個成員，SMP 亞組中有6 個成員。

1.3 研究目的

本研究旨在研究不同生境下蘆葦細胞中的內質網未折疊蛋白反應及LEA 蛋白表達差異，并對結果進行對比分析，得出二者對蘆葦細胞抗逆性的影響和對環境的適應性，從而推進蘆葦凈化水質以及提高其他植物抗逆能力的生產生活應用。

2 蘆葦LEA 蛋白基因

2.1 LEA 蛋白采樣篩選區域

對玉淵潭6 個不同位置的蘆葦進行采樣，每個位置采集3 株蘆葦的葉片，并將其分別儲存到-70℃的冰箱中。

2.2 蘆葦LEA 基因選取

張茜針對蘆葦融合數據庫（ALL）中找到的48個LEA 基因，在四倍體和八倍體蘆葦中開展N + P響應的實驗后發現如下結果。

在蘆葦中發現77 條編碼LEA 蛋白家族的基因，其中3 個LEA_2（PB.12079.1，PB.7780.1 and PB.49.1）和2 個脫水素（PB.2879.1 and PB.8282.1），其轉錄水平在蘆葦四倍體中明顯低于八倍體。意外的是，有一個基因（LEA_1PB.10905.1）在四倍體中的表達量高于八倍體。這可能會成為一種在轉錄水平上分辨蘆葦染色體組倍性的新方法[2]。

因此，可以利用此6 個基因作為具有明顯差異的蘆葦LEA 基因，并將其作為模板設計引物。

2.3 RT-PCR 半定量分析

2.3.1RT-PCR 結果分析

相關基因引物設計

使用NCBI 引物設計網站導入目的基因，選取TM 值在55 左右，F、R 差距在3 以內，引物互補且特異性好的6 種引物（如圖1 所示）。

圖1 導入的6 種相關基因引物

2.3.2 PCR 結果及分析（圖2）

圖2 凝膠掃描圖像結果

其中，4×、8×分別表示蘆葦的四倍體和八倍體，1～6 分別為在玉淵潭6 個位置進行的采樣。

由圖可見，可通過樣本獲得的清晰多態性條帶，將6 種不同的蘆葦樣本進行分類，并根據條帶的分布位置確定是哪一種蘆葦樣本，具有一定的區分度。PB.2879.1 所顯示的條帶在材料3、4、5、6 中有所表達，在其他材料中的表達較少，且2 在此基因中表達也是最少的。PB.7780.1 的上帶在4×、8×中表達較少，在1、2、3、4、5、6 中表達量逐漸增加，其中在3、5、6 中表達最多；而PB.7780.1 的下帶則與之相反，在4×、8×、1、2 中表達量較多，而在3、4、5、6 中幾乎不表達。PB.12079.1 在4×、8×中表達量較少，在1、2、3、4、5、6 中表達量高于4×、8×且幾乎無差異。

PB.8282.1 和PB.10905.1 表達量較高且幾乎無差異。

實驗中的PB.7780.1 出現了兩條較為明顯的條帶，推測是因為保存處理不當而導致DNA 降解，因此在日后實驗過程中需要注意DNA 的保存問題并提高點樣的準確性，以減少一定的操作性誤差。

3 結論

綜上，所有蘆葦LEA 蛋白的蛋白序列長度在69～455 個氨基酸之間，分子質量在7.38～49.47 kDa之間，理論等電點在4.25～11.22 之間；疏水性蛋白多集中在LEA_2 家族中；有57 個蘆葦LEA 蛋白的不穩定系數大于40；脂肪族指數在26.91～130.77 之間。

選取的基因后續通過RT-PCR 進行表達量驗證，4×和8×材料由于倍性變化導致其與自然生境下的蘆葦材料表達量有所差異，因此可利用其中差異較大的PB.12079.1、PB.2879.1、PB.10905.1 來對未知蘆葦判斷其倍性是否變化，其具體原因有待進一步深入研究。