代謝型谷氨酸受體5 的純化及納米抗體的篩選

王 輝，馬夢潔，許劍鋒*

1.上海海洋大學，上海 201306；2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203;3.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306

谷氨酸（Glutamate，Glu）主要是在Glu 受體（Glu receptor，GluR）介導下調節大腦神經元興奮性和代謝活動的重要興奮性神經遞質之一，代謝型谷氨酸受體（Metabotropic glutamate receptors，mGluR）屬于谷氨酸受體的一種類型（另一類為離子型谷氨酸受體），該受體是GPCR 家族C 組成員[1]。mGluR5 主要以二聚體的形式分布在大腦皮質、海馬和紋狀體等區域，通過激活信號通路，廣泛參與調控突觸傳遞、突觸可塑性、神經興奮性/抑制性平衡等生理過程，對維系神經網絡至關重要[2]。在病理條件下，它是一種公認的治療靶點，與多種腦疾病有關。盡管有可靠的臨床前數據，但mGluR5 拮抗劑在幾項臨床試驗中都失敗了，這表明需要深入地了解mGluR5 功能背后的機制[3]，其作為神經和精神疾病的潛在藥物靶標日益受到相關研究人員的關注。

納米抗體只包括一個重鏈可變區（VHH）和兩個常規的CH2與CH3區，不像經過人工改造的單鏈抗體片段（scFv）那樣容易互相沾粘，甚至聚集成塊[4]。相反，其具備分子質量小，能夠穿透血腦屏障，特異性和親和力高，表達量高和對人體的免疫原性較弱等優勢。本文通過對駱駝免疫，篩選出與mGluR5特異性結合較高的納米抗體，然后以納米抗體為中間體進行一系列改造，使mGluR5 靶向成藥成為可能[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DNA Polymerase、T4 DNA Ligase 從南京諾唯贊購入；淋巴細胞分離液從GE Healthcare 公司購入；RNeasy PlusMiniKit 從 QIAGEN 公司購入；TIANquick Midi Purification Kit、TIANgel Midi PurificationKit 均購自天根生化科技（北京）有限公司；293s 細胞、M13KO7 輔助噬菌體購自NEB 公司；Mouse Anti- HA-tag Antibody、HRP Goat Antimouse IgGH+L）Antibody 從上海翌圣生物科技有限公司購入；M2 親和層析柱；Ni-NTA His 結合樹脂從Sigma 公司購入。

1.2 方法

1.2.1 mGluR5 真核表達載體的構建

從NCBI 上查找編碼野生型人mGluR5 的21-835 位氨基酸殘基的堿基序列，將血凝素（HA）信號肽、標志表位標簽（DYKDDDDK）和3-丙氨酸連接物添加到N 端，然后在蘇州金唯智生物科技有限公司合成，設計上游引物、下游引物；將改造后的mGluR5 和CMV-Flag 載體進行雙酶切，酶切后的產物提純后進行連接，將連接好的產物用Top10 感受態細胞進行轉化，次日隨機挑取轉化出來的細菌，用上下游引物進行菌落PCR，將菌落PCR 結果為陽性的進行質粒測序，和原始序列進行對比[6]。

1.2.2 mGluR5 的表達純化

利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統（Invitgen）制備重組桿狀病毒[7]。800 mL 293 s 細胞，病毒比例1∶20，用10 mM 正丁酸鈉30 ℃和135RPM 誘導3 d，離心收集細胞，在含有10 mM Tris 和1 mM EDTA 的低滲緩沖液中（pH 為7.8）和1 mM EDTA中裂解，然后勻漿[8]；用離心法收集細胞膜微球，分別用20 mM HEPES，10% Glycerol，10 mM NaCl，0.01% LMNG，1% Coaktail，10 μM FFMTEP，0.2%膽固醇琥珀酸半酯（CHS）（類固醇）和10 μM FFMTEB（化合物）在4 ℃冷庫旋轉孵育2 h。FFMTEB（3-fluoro-5-（2-（2-（fluoromethyl）thiazol-4-yl）ethynyl）benzonitrile）是F-MTEB 的氟化類似物，對mGluR5具有極高的親和力及選擇性；用20 mM HEPES，10% Glycerol，10 mM NaCl，0.01% LMNG，10 μM FFMTEP，2 mM CaCl2洗滌[9]。與M2 柱子結合的mGluR5 在20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，0.005% （W/V）LMNG，10 μM FFMTEP，0.2 mg/mL flag 和5 mM EDTA 洗脫。蛋白經50 kDa 截留的Vivaspin（微孔）濾膜濃縮，濃縮至500 μL 過Superose 6，10/300 GL 柱（GE Healthcare）進行分離，測濃度計算質量，在蛋白中稱取3 倍質量的A835，混合均勻吸取蛋白體積1/2 活化的Bio-beads（500 uL），將蛋白加入其中，4 ℃旋轉過夜吸附Detergent后，換等量的活化Bio-beads 4 ℃旋轉吸附4 h，經吸附A835 包裝后的蛋白過Superose 6 柱子進行分離[10]。通過SDS-PAGE 凝膠電泳確認蛋白。

圖1 mGluR5-CMV-Flag 載體的構建

圖3 噬菌體展示抗體庫的構建

圖4 抗mGluR5 納米抗體的篩選

1.2.3 mGluR5 蛋白免疫野生單峰駝

將1 mg mGluR5 蛋白與GERBU Adjuvant FamaTM 佐劑按1∶1 混勻，注射于野生雙峰駝頸部的淋巴結處，總共需要對駱駝進行7 次免疫，每次間隔時間為1 周，最后一次免疫1 周后抽取200 mL駱駝的外周血[11]。

1.2.4 噬菌體展示抗體庫的構建

將150 mL 的駱駝外周血與等體積的0.9%氯化鈉溶液輕晃混勻，將稀釋的外周血按10 mL 每管慢慢注入15 mL 每管淋巴細胞分離液液面上，通過低速離心使外周血分為4 層，用移液槍小心吸出淋巴細胞層進行總RNA 的提取，再逆轉錄為cDNA[12]。用表1 中的引物對cDNA 進行巢式PCR 將VHH 片段進行擴增并與pMECS 噬菌粒載體進行連接；用電轉化的方法轉化到TG1 大腸桿菌中（條件為：電壓1 800 V，電阻200 Ω，電容25 μF，時間恒定值在4.5～5.5 ms 之內）；用SOC 培養基進行復蘇1 h，吸出10 μL 細菌懸液加入到990 μL 37 ℃預熱的SOC 培養基中，混勻；取100 μL 涂布在含2%葡萄糖，氨芐抗性的9 cm 直徑LB 平板上（即稀釋103 倍，可進一步梯度稀釋至104 倍、105 倍和106 倍），37 ℃倒置培養過夜后，統計菌落數用來測噬菌體抗體庫的庫容[13]。將剩下的細菌懸液每200 μL 涂布在1 塊含2%葡萄糖，氨芐抗性的15 cm 直徑LB 平板上，37℃倒置培養過夜；用6 mL LB 培養基潤濕15 cm 直徑LB 平板，用無菌細胞刮將細菌收集到一個100 mL 收菌瓶中；取10 μL 細菌，稀釋200 倍，測量并記錄OD600nm值（擴增倍數為104 以上）；向收菌瓶中加入1/3 體積的無菌80%甘油，混勻后在保存在-80 ℃; 隨機挑取20 個菌落，從9 cm 直徑LB 平板上，用MP57 引物和GIII 引物進行菌落PCR（如果連接體系中每100 ng 載體的轉化效率低于5×105，或插入抗體片段的比例小于75%，則需要重新進行酶切和連接）[14]。

表1 VHH 片段PCR 擴增引物

1.2.5 mGluR5 特異性納米抗體的液相淘選

將M13KO7 輔助噬菌體和文庫菌按20∶1 的量進行混勻，在37 ℃的培養箱中孵育30 min，用3 200 g 離心10 min 棄去多余的噬菌體，再用2×YT/Amp/Kana 培養基，將菌重懸起來過夜培養；次日3 200 g 離心取上清，用1/4 倍體積的PEG/NaCl 沉淀噬菌體0.5 h 后離心棄上清，用PBS 重懸噬菌體后測滴度備用[15]。用含5 μg/mL NeutrAvidin biotinbinding protein 的PBS 4 ℃過夜包被Maxisorp 96 孔板（每孔100 μL），棄去NeutrAvidin，用含1% BSA的Buffer（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）洗5 次，加入2% BSA 封閉2 h，洗去BSA，實驗組加入5 μg/mL 抑制狀態的mGluR5 抗原稀釋液封閉30 min（對照組不加抗原），洗去抗原稀釋液，加入1×1012CFU/孔噬菌體稀釋液封閉2 h，洗去噬菌體封閉液，加入25 μg 胰酶消化30 min，加入1/20 體積的4 mg/mL AEBSF 來終止胰酶消化[16]。實驗組/對照組各取10 μL 洗脫噬菌體進行10 倍梯度稀釋，測定Output 噬菌體的滴度。計算特異性結合的富集率，如需新一輪淘選，過程同上[17]。

1.2.6 mGluR5 特異性納米抗體的鑒定

從最后一輪淘選的TG1 大腸桿菌中隨機挑選單克隆制備母板，從制備的母板中吸取20 uL～1 mL的2×YT/Amp 刻培養基中，220 r/min、37 ℃培養5 h后加入IPTG 進行過夜誘導表達納米抗體[18]。用含5 μg/mL NeutrAvidin biotin-binding protein 的PBS 4℃過夜包被Maxisorp 96 孔板（每孔100 μL），次日將菌液離心后棄去上清，每孔加入100 uL 的PBS進行反復凍融裂解細菌，離心后取上清備用；用含1% BSA 的buffer（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）將過夜包被的96 孔板洗5 次，加入2% BSA封閉2 h，洗去BSA，加入5 μg/mL 抑制狀態的mGluR5 抗原稀釋液封閉30 min；洗去未結合的抗原，加入備用的納米抗體孵育1 h，加入Mouse Anti-HA-tag Antibody 稀釋液孵育1 h；洗去一抗加入HRP Goat Anti-mouse IgG（H+L）稀釋液孵育1 h，洗去二抗采用ELISA-TMB 顯色試劑盒進行顯色[19]。用SpectraMax M5 Microplate reader 在450 nm 處讀取光吸收值，將吸收值大于對照組3 倍以上的納米抗體進行測序，用Vector NTI 軟件對堿基序列進行分析[20]。

2 結果討論

2.1 mGluR5 真核表達載體的構建

mGluR5 片段大小為2 529 bp，將mGluR5 片段進行PCR 擴增后，用1%的凝膠進行電泳驗證結果（圖1a）與目的條帶相符合，將mGluR5 片段構建到CMV-Flag 載體中（圖1b），進行菌落PCR 驗證的結果（圖1c）。

2.2 mGluR5 的表達純化

將蛋白表達后融膜進行純化，用Superose 6，10/300 GL 柱進行分離（圖2a），將鋒尖蛋白跑SDSPAGE 凝膠電泳確認蛋白大小，確認鋒尖蛋白為目的蛋白（圖2c），經吸附過后A835 包裝后的蛋白過superose 6 柱子（圖2b）進行分離，將鋒尖蛋白跑SDS-PAGE 凝膠電泳進行確認（圖2d），確認鋒尖蛋白為目的蛋白收集峰尖蛋白，將濃縮至一定濃度，加甘油分裝凍存。

2.3 噬菌體展示抗體庫的構建及庫容的測定

對分離后的淋巴細胞總RNA 進行提取，RNA提取結果如圖3a，用巢式PCR 對250～500 bp 之間的VHH 片段進行擴增（圖3b），將擴增后的片段插到pMECS 噬菌粒載體中，通過電轉化將構建好的質粒轉化到TG1 電感受態細胞中，進行噬菌體展示抗體庫的構建；通過測量大腸桿菌轉化的效率對庫容進行計算5.47×108CFU/mL，陽性率為95%（圖3c）。

2.4 mGluR5 特異性納米抗體的液相淘選

利用抑制狀態的mGluR5 對構建的噬菌體展示抗體庫進行液相淘選，經過兩輪的富集淘選，實驗組比對照組的富集度達到了30 倍（圖4a），用最后一輪洗脫的噬菌體侵染TG1 大腸桿菌，按合適的倍數進行稀釋，涂布到150 mm 的2×YT/Amp/Glu 平板上，隨機挑取190 個單克隆進行納米抗體的粗表達，通過Elisa 進行驗證結合，淘選出12 個讀數較高的納米抗體，用Vector NTI 對納米抗體進行序列分析（圖4b）。

3 討論

純化出抑制狀態的mGluR5，通過免疫雙峰駝構建了庫容為5.47×108CFU/mL 陽性率為95%的噬菌體文庫，并通過噬菌體展示技術，篩選出了12 個不同的陽性克隆。本研究獲得的高親和力納米抗體可以為研究mGluR5 蛋白的性質和介導的信號通路提供很好的納米抗體工具，為mGluR5 的深層次研究奠定了基礎。

mGluR5 是信號通路中的一個重要蛋白，調控著眾多信號傳導，通過作用于它，可以治療很多相關疾病，順利構建純化出人的抑制型mGluR5 蛋白；利用包裹A8-35 的方法對蛋白進行生物素化，很好地避免了淘選時對蛋白表位的遮擋，通過多次液相淘選，可以篩選出各個表位、高親和力的納米抗體。傳統的抗體體積都比較大，納米抗體具有體積小特異性強等特點，可以更好地與mGluR5 蛋白結合并且減少對蛋白結構性質的影響；筆者成功免疫雙峰駝篩選出抑制型mGluR5 蛋白的納米抗體，為后續研究mGluR5 奠定了基礎。

mGluR5 蛋白是一個很有潛力的靶點，直接作用于它是比較困難的，現有的一些激動劑或抑制劑都有一定的局限性，可以通過改造與mGluR5 蛋白特異性結合的納米抗體來間接作用于它，開發和運用一些具有高選擇性的激動劑和拮抗劑。這為研究mGluR5 蛋白的性質和介導的信號通路提供了方法，可以推動mGluR5 與中樞神經系統疾病的研究，為神經系統疾病的治療提供新思路，最終能夠達到治療疾病的目的。