葡萄糖氧化酶產生菌的誘變育種及發酵工藝優化

趙芬芬，黃月榮，趙 輝，吳 靜，姜冬冬

1.鄭州黃河護理職業學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州源創基因科技有限公司，河南 鄭州 450000

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一種重要的工業酶制劑，其在有氧條件下能夠專一地將β-D-葡萄糖氧化，同時產生過氧化氫和葡萄糖酸[1]。GOD 當前被廣泛應用于食品、醫藥、飼料等領域。目前可用于工業化生產GOD 的菌株共有30 多種，但大部分菌種都存在活化程度低、發酵時間長、產酶率低等問題。因此，選育高活性的GOD 生產菌株，開發一種用于GOD 菌種活化生產的培養基，對于縮短發酵周期、提高產酶量、降低生產成本具有重要現實意義。本文以桔青霉為生產菌株，對其進行誘變處理，并設計了一種快速篩選高產菌株的方法，以農業廢棄物為基質發酵生產酶，對發酵條件和培養基組分進行優化，經過優化的GOD 產量得到了明顯提高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桔青霉（Penicillium citrinum）CICC40277 購買自中國工業微生物菌種保藏中心。

培養基：

（1）孢子培養液（g/L）：Sucrose 30.0，NaNO33.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.012，K2HPO41.0，pH 為6.0～6.5。

（2）種子固體培養基：選定固液比為1∶1（W/V），取固體基質（葡萄皮、香蕉皮、橘子皮、甘蔗渣、木薯葉、甜茶葉、麥麩）各5 g 置于250 mL 三角瓶中，分別加入5 mL 無機鹽溶液（Yeast powder 2.0、MgSO4·7H2O 0.5、Na2HPO42.0、KCl 0.3、CaCO33.0，單位：g/L），pH為6.0～6.5，攪拌混勻。

（3）液體發酵培養基（g/L）：Sucrose 30.0，Yeast powder 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO42.0，KCl 0.3，CaCO33.0，pH 為6.0～6.5，攪拌混勻。

（4）誘變篩選培養基：即添加有2-脫氧-D-葡萄糖（1 g/L）的馬鈴薯瓊脂培養基，加入0.001%（W/V）的甲基紅作為指示劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化

將購買的菌株取出，加入40 mL 孢子培養液，洗脫至250 mL 三角瓶中。置于搖床上振蕩培養2 h，培養溫度為30 ℃，搖床轉速為180 r/min。

1.2.2 種子固體發酵

將發酵培養基置于121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后接種孢子懸浮液，接種量為20%（V/V）。放置在恒溫培養箱中進行培養，溫度設置為30 ℃。發酵結束后，向菌種固體發酵培養基中加入40mL pH 為7.0 的磷酸緩沖液。于30 ℃、200 r/min 的搖床上震蕩浸提1 h，所得浸提液即為種子培養液。

1.2.3 液體發酵培養

將經過固體培養基活化后的種子培養液接種到液體發酵培養基中，接種量為20%（V/V），于30 ℃、200 r/min 的搖床上震蕩發酵培養12 h，離心后出取上清液，即得粗酶液。

1.2.4 高產GOD 菌株的誘變篩選

將經過紫外誘變（紫外燈功率為30 W，照射距離為10 cm，照射時間分別為0、1、2、3、4、5、6 min）和微波輻射誘變（微波爐功率800 W，頻率2 450 MHz，處理時間分別為0、20、30、40、50、60 s）處理后的孢子懸浮液涂布在誘變篩選培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中避光培養5 d 后，挑選形態較大、周圍變色圈較大的菌落進行液體發酵培養，測定其產酶能力。

1.2.5 種子固體培養基發酵條件的優化

對固液比、發酵時間、溫度、pH、接種量等方面進行單因素優化。

1.2.6 種子固體培養基發酵組分的優化

在已確定最適發酵條件的基礎上，研究不同的碳源、氮源對菌株產酶活力的影響。選用乳糖、蜂蜜、淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖分別作為碳源，添加量為5%（W/V），研究不同碳源對酶活力的影響。在確定最佳碳源后，再進一步研究其濃度從1%～11%（W/V）對菌株產酶效率的影響。在此基礎上，選用NHCl、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NaNO3、Yeast powder 和蛋白胨分別作為氮源，添加量為0.5%（W/V），在確定最適氮源后，對其位于0.2%～1.2%（W/V）之間的最適濃度繼續進行研究。

1.2.7 GOD 酶活力的測定

參照周建芹等[2]所建立的靛藍胭脂紅褪色分光光度法來測定GOD 的活力，公式如下：

式中：C 為根據標準曲線計算得到的H2O2濃度變化值；V為反應液體積（mL）；Df 為酶液稀釋倍數；T為反應時間（min）；Ve 為酶液體積（mL）。

2 結果與分析

2.1 不同種子培養方式對桔青霉產GOD 的影響

本實驗考察了固、液發酵兩種體系對菌種產酶的影響，實驗結果顯示，液體發酵和固體發酵兩種發酵體系均可用于種子的活化培養。在液體培養體系中，需要經過120 h 的種子發酵培養，GOD 的酶活最高僅能達到24.96 U/g；而在固體發酵體系中，以木薯葉為固體基質的種子培養基，僅需經過96 h 的活化培養，GOD 的酶活就可達到最高值66.48 U/g。

2.2 誘變結果

經紫外、微波誘變后篩選得到96 株耐受2-脫氧-D 葡萄糖的菌株，根據菌落周圍紅色圈的大小挑出44 株菌予以發酵培養，其中有9 株菌的酶活要高于原始菌株（66.48 U/g），而在這其中又屬Uv-7 號菌株的酶活最高，達到了79.76 U/g，與原始菌株相比酶活提高了20%。

2.3 P.citrinum Uv-7 產GOD 菌種固體發酵條件的優化結果

本實驗考察了不同固液比、發酵時間、溫度、pH、接種量對菌種固體發酵產酶的影響，由圖1-（a）可知，當固液比為1∶1（W/V）時，菌株產GOD 的酶活最高，達到73.84 U/g；當接種量為20%（V/V）時，菌體生長旺盛，GOD 的產量達到最大值77.76 U/g；經過144 h 的恒溫固體培養活化后，GOD 的酶活力達到最大值78.96 U/g；當鹽溶液的pH 為6.0 時，GOD 的產量達到最大值79.2 U/g；不同溫度下菌種的生長狀態呈現出顯著差異，當培養溫度為30 ℃時，酶活達到最大值79.76 U/g。

圖1 菌種培養基發酵條件對葡萄糖氧化酶產量的影響

2.4 P.citrinum Uv-7 產葡萄糖氧化酶發酵培養基組分的優化結果

本實驗還研究了不同的碳源、氮源對菌株活化產GOD 的影響，實驗結果如圖1-（b）所示。由圖可知，選用葡萄糖作為碳源時，GOD 的產量最高，達到91.76 U/g；當葡萄糖的添加量為3%（W/V）時，酶活力達到最大值101.52 U/g。研究結果表明，只需額外添加少量的葡萄糖即可顯著提高葡萄糖氧化酶的產量，這可能是因為木薯葉中所含有的糖類物質已經基本滿足了菌體對碳源的需求。

2.5 木薯葉菌種培養基成本核算

經單因素優化后得到木薯葉菌種培養基最優輔料組分為：5.5 g 木薯葉，按照1∶1（W/V）的固液比添加鹽溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 0.5、Na2HPO42.0、KCl 0.3、CaCO33.0、葡萄糖30、酵母粉6，pH 為6.0。根據2022 年相關材料數據進行核算，得出木薯葉菌種培養基成本僅需65.889 元/t。

3 結論

本研究通過比較固、液培養對菌種生長與產酶量的影響，確定了最優菌種活化體系是以木薯葉為基質，經96 h 培養后，GOD 的活性達到66.48 U/g，與液體活化（24.96 U/g）相比提高了2.66 倍。然后采用單因素試驗對P.citrinum Uv-7 菌株產GOD 的最佳菌種培養條件進行優化，發現菌株產GOD 的活性從66.48 U/g 提高到了101.52 U/g，提高率為52.7%。廖兆民等[3]采用基因克隆的方式，將黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中進行共表達后對產酶條件進行優化，其GOD 酶活相比初始重組酵母提高了50.2%。而本研究經菌種固體發酵培養后，經菌種固體發酵培養后，僅需24 h 的液體發酵即可獲得較高的酶活，大大縮短了整體發酵培養時間，有利于節約工業化生產成本和時間。

對木薯葉菌種固體培養基進行成本核算，得到其成本僅需65.889 元/t。張慶芳等[4]通過研究得到液體種子培養基組分為葡萄糖6%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.02%、MgSO4·7H2O 0.07%、KCl 0.05%、NaNO30.4%，pH 為7.0 時，按照同樣的標準核算后，其成本為134.032 元/t，而本研究的成本與之相比減少了68.143 元/t。

采用2-脫氧-D-葡萄糖為菌株抑制劑和甲基紅為指示劑建立了一種高效、簡便的篩選方法。2-脫氧-D-葡萄糖可以抑制細菌的生長，但對產GOD菌株的生長無抑制作用[5]。GOD 能夠使葡萄糖氧化，生成葡萄糖酸，從而使培養基的酸性增強。本研究以甲基紅為指示劑，通過顯色圈的大小可以快速的篩選出高產GOD 的菌株，該試劑安全、低毒、經濟，高效。

本研究結果為葡萄糖氧化酶的安全工業化發酵生產提供了理論依據和數據支持。證明了固體發酵不僅能使生產成本有所降低，而且能使菌株產酶性能也明顯提高。

中國是農業大國，利用農業廢棄物為基質發酵生產酶等副產品，可實現農業經濟效益和生態效益的同步提升。