土壤調理劑對露天煤礦排土場土壤酶活和微生物多樣性的影響

于鑫鑫，王 芷，劉 莉

1.國能準能集團有限責任公司，內蒙古 自治區鄂爾多斯 010300；2.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；3.中國科學院上海高等研究院，上海 201210；4.上海有機固廢生物轉化工程技術研究中心，上海 200241

黑岱溝露天煤礦位于我國優質煤炭資源富集的內蒙古鄂爾多斯市，總占地面積65.46 km2，是我國建設的四大露天礦之一。近年來，礦區煤炭的大量開采造成了生態環境破壞和土地資源耗竭[1]。因此，提高礦區土地利用率、改善土壤生態環境意義重大。露天煤礦在開采過程中產生的損毀地主要為排土場，一般占礦山用地的50%以上[2]。排土場表層土壤存在孔隙度小、保水能力差、徑流嚴重、養分貧瘠、微生物活性弱、不利于植物生長等問題[3]。

將土壤調理劑應用于土壤改良是當前研究的熱點。土壤調理劑是指在障礙土壤中用來改善土壤的物理、化學、生物性狀的物料，進而改良土壤結構、改善土壤水分狀況或土壤生態環境。目前已有將有機肥、保水劑、微生物菌劑兩兩組合制成土壤調理劑的研究。如曹遠博等[4]的研究表明，在黃土坡地使用保水劑和有機肥制成的土壤調理劑能夠有效改善土壤的抗侵蝕能力，對削弱地表徑流也有正面作用。蔣美佳等[5]發現有機肥和保水劑配施可有效減少氮素的淋失。王榮等[6]發現使用保水劑和有機肥的實驗組與使用傳統水溶肥的對照組相比，明顯提高了0～20 cm 土壤的電導率和養分含量，降低了土壤酸堿度，進而提高了黃瓜的產量和營養質量。李想等[7,8]在廢棄鐵尾礦中使用了含有保水劑和有機肥的土壤調理劑，發現0～20 cm 層的土壤性質得到了明顯改善，但是單獨使用有機肥并不能達到這種效果；在此基礎上，通過設置兩種材料的不同使用條件和使用量，研究紫花苜蓿和紫穗槐的生長發育狀況，結果表明20 L/m3的保水劑與22.49 kg/m2的有機肥對實驗裸尾礦土壤的植物生長發育的促進效果良好?？诐萚2]使用膠質芽孢桿菌與苜蓿根瘤菌雙接種處理，顯著提高了排土場的土壤熟化程度和復墾效果。在康藏高原地區以6 種牧草為實驗對象進行土壤改良的田間實驗，結果表明，在同一保濕處理下，多數牧草的各項測定指標表現為：菌劑與肥料配施>單施微生物菌劑>單施復合肥>不施肥，且在雙倍保濕劑下表現更好[9]。宋雙雙等[10]將不同濃度的微生物菌劑與保水劑進行搭配，混合使用到種植油松和紫花苜蓿的土壤中，發現不同濃度組合對土壤速效養分含量的提升效果不同，高濃度的保水劑和菌劑會顯著提高土壤速效氮的含量，中濃度的菌劑用量能使土壤持水能力得到提升，過量則會降低保水劑的保水效果。

本研究主要針對排土場土壤恢復利用后的種植層土壤進行改良，將有機肥、保水劑和微生物菌劑三者聯合制成土壤調理劑來改善排土場土壤微生物環境。目前，共同使用這3 種材料進行礦區復墾土壤改良的研究較少，本研究不僅可為露天煤礦排土場復墾土壤的改良提供理論依據和參考數據，同時也能為其他干旱地區土壤改良提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤取自內蒙古鄂爾多斯市準格爾旗黑岱溝露天煤礦排土場標高1 330 m 處的新排土樣。土樣自然風干，過孔徑1 mm 篩，用于盆栽實驗。該土壤pH 為8.7，電導率97 μs/cm，有機質含量為1.82 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為32.67、2.0、148.72 mg/kg。實驗使用的土壤調理劑中保水劑、有機肥、微生物菌劑的具體信息見表1。根據實地考察情況，小白菜為當地常見經濟作物，且生長周期相對較短，因此以小白菜作為驗證植物。

表1 實驗材料

1.2 實驗設計

本研究通過在溫室中進行盆栽實驗。利用塑料PP 盒做容器（直徑11 cm，高11.5 cm 的圓柱體），使用電鉆在底部均勻的打8 個直徑1 cm 的孔用于排水，每盆裝入1 kg 風干后的排土場土壤。根據前期實驗研究，將5‰（以占盆栽用土總重量計算）保水劑和30%（以占盆栽用土總重量計算）有機肥與排土場土壤進行混合，均勻裝入盆中。播散小白菜種子前，為每盆干土澆水500 mL，確保土壤完全濕透，然后添加微生物菌劑，微生物菌劑使用總量梯度設置為0 mL/盆、5 mL/盆、10 mL/盆，每次以設置的總使用量的1/5 混在澆灌用水中，第一次在播種前使用，后續每7 d 施用1 次；然后分別在第0、25 和50天3 個階段取樣檢測土壤酶活和微生物多樣性。設置4 個處理組，分別為對照組（CK）、5‰保水劑和30%有機肥（W0）、5‰保水劑和30%有機肥以及5 mL 微生物菌劑（W1）、5‰保水劑和30%有機肥以及10 mL 微生物菌劑（W2），每個處理均設置3 次重復。

1.3 土壤指標測定

1.3.1 6 種土壤酶活

土壤酶活采用《土壤酶及其研究方法》[11]進行測定。其中，過氧化氫酶（S-CA）酶活采用比色法測定，纖維素酶（S-CL）酶活采用3，5-二硝基水楊酸法測定，蔗糖酶（S-SC）酶活采用3，5-二硝基水楊酸法測定，脲酶（S-UE）酶活采用苯酚鈉比色法測定，堿性磷酸酶（S-AKP）酶活采用磷酸苯二鈉比色法測定，堿性蛋白酶（S-ALPT）酶活采用比色法測定。

1.3.2 土壤微生物多樣性

每個土壤樣本稱取10 g（每個樣本由對應的3個平行樣混合均勻），交付上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序，包括土壤總DNA 的提取、純化與定量，以帶有barcode 序列的338F-806R 為引物進行PCR 擴增，PCR 擴增采用細菌通用引物為338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’及806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

1.4 數據分析

通過SPSS 軟件進行數據分析，所有實驗重復3次，結果顯示平均值、±標準誤差；采用Origrin9.1 進行繪圖；微生物多樣性分析采用Illumina 公司Miseq PE300 平臺。

2 結果與分析

2.1 土壤調理劑對土壤酶活的影響

對各組土壤在3 個時間點的過氧化氫酶（SCA）、纖維素酶（S-CL）、蔗糖酶（S-SC）、脲酶（SUE）、堿性磷酸酶（S-AKP）、堿性蛋白酶（S-ALPT）這6 種酶的酶活進行重復測量方差分析，探究4 個分組的土壤條件是否會對6 種酶活性產生影響，得出主體間效應檢驗結果，見表2。

表2 6 種土壤酶活性的主體間效應檢驗

2.1.1 土壤調理劑對土壤過氧化氫酶（S-CA）酶活的影響

從圖1 中可以看出，CK 組過氧化氫酶（S-CA）酶活隨著種植時間的增長，活性呈下降趨勢，但添加了土壤調理劑的3 組處理隨著種植時間的改變，其過氧化氫酶酶活均呈現先增高后降低的趨勢。在第0 天時，添加了土壤調理劑的土壤并沒有比對照組擁有更高的過氧化氫酶活性，但是到25 和50 d 時，只要添加了保水劑與有機肥的土壤，其過氧化氫酶活性都顯著提高，而菌劑的兩個不同使用量處理組并沒有帶來更有效的結果。

圖1 土壤酶活變化

2.1.2 土壤調理劑對土壤纖維素酶（S-CL）酶活的影響

從圖1 中可以看出，所有處理組的土壤纖維素酶（S-CL）酶活隨著種植時間的增長，均呈現出先升后降的趨勢。所有分組第0 天的纖維素酶酶活無顯著差異。在第25 天和第50 天時，發現使用5 mL 菌劑的組始終擁有明顯的高纖維素酶活性，使用了保水劑和有機肥的組較對照組也擁有更顯著的高纖維素酶活性。

2.1.3 土壤調理劑對土壤蔗糖酶（S-SC）酶活的影響

從圖1 中可以看出，無論在哪個種植時間點，3個實驗組的蔗糖酶（S-SC）酶活都顯著高于CK 組。在同一時間下，分析各處理組之間的蔗糖酶酶活差異發現，有機肥和保水劑的添加能夠明顯提高土壤蔗糖酶活性，但菌劑的兩個使用量對于土壤蔗糖酶活性沒有明顯影響。

2.1.4 土壤調理劑對土壤脲酶（S-UE）酶活的影響

從圖1 中可以看到，隨著種植時間的變化，除了添加10 mL 微生物菌劑的處理組呈現脲酶（S-UE）酶活逐步降低的趨勢，其他3 組均呈現先降低后升高的變化趨勢。在同一時間下，對照組的土壤脲酶活性在任何時間內均顯著低于其他處理組，說明有機肥和保水劑的添加能夠提高土壤脲酶活性，但菌劑的兩個使用量并沒有對土壤脲酶活性帶來明顯改變。

2.1.5 土壤調理劑對土壤堿性磷酸酶（S-AKP）酶活的影響

從圖1 中可以看出，除添加了10 mL 微生物菌劑的土壤堿性磷酸酶（S-AKP）酶活隨著種植時間的變化呈現先升高后降低的趨勢外，其余所有處理組均呈現隨種植進程活性逐漸升高的趨勢。在任何一個時間點，對照組的堿性磷酸酶活性均顯著低于其他的改良處理組，但各處理組之間差異均不顯著。這說明有機肥和保水劑的添加對于土壤堿性磷酸酶的活性有提升作用，但菌劑的兩個使用量沒有帶來類似的效果。

2.1.6 土壤調理劑對土壤堿性蛋白酶（S-ALPT）酶活的影響

從圖1 中可以看出，隨著種植進程的時間變化，CK 組的土壤堿性蛋白酶（S-ALPT）酶活呈現先降低后升高的趨勢，而其余3 個處理組均呈現逐步升高的趨勢。根據主體間效應檢驗結果可知，分組不起作用，即土壤堿性蛋白酶活性不受土壤改良材料的影響。

2.2 土壤調理劑對土壤微生物多樣性的影響

由高通量測序結果進行OTU 物種分類可知，在12 個樣本中共檢測出40 個細菌門。在進行數據分析前先對所有樣本按照最小樣本數進行抽平，抽平序列數為27 142 條序列，選取相關指標進行Alpha多樣性分析，結果如表3 所示。

表3 不同處理組對土壤微生物多樣性的影響

如表3 所示，所有處理組在任何時期的樣本測序覆蓋度均達到98.50%以上。Sobs 指數值越大，代表群落豐富度越高。分析可知，隨著時間的變化，4個分組群落豐富度逐漸升高；在同一時間的土壤樣品中，CK 組的群落豐富度明顯低于其余3 個處理組；對于3 個菌劑添加量不同的處理組，在第0 天時，菌劑添加量多的樣本土壤微生物豐富度反而更低，但到中后期階段，能看到添加菌劑組的土壤微生物豐富度已然追趕上來，說明所用的菌劑產品和用量可能在長時間下才能對實驗土壤發揮作用。Shannon 指數能夠反映群落的多樣性，Shannon 指數值越大，代表群落擁有越高的多樣性。由上表可知，各處理組隨著時間的變化，Shannon 指數總體呈上升趨勢；在3 個檢測時間點，CK 組的Shannon 指數均低于其余3 個處理組，說明添加土壤調理劑，增加了土壤微生物多樣性；僅微生物菌劑用量不同的W0、W1、W2 組整體上來講，微生物菌劑用量越多，微生物多樣性越高，說明菌劑的添加有利于提高土壤中微生物的多樣性水平。

2.3 土壤調理劑對土壤微生物群落組成的影響

在門水平上對所有樣本的細菌群落結構進行分析并繪制bar 圖，見圖2。

圖2 門水平上不同樣本的土壤細菌組成相對豐度

在門水平上將樣本中相對豐度<1%的類群歸為其他，相對豐度>1%的類群有12 個，如圖2 所示。可以看到，在所有樣本中，放線菌門（Actinobacteriota）和變形菌門（Proteobacteria）的含量都是最多的，且在任何一個樣本中，兩種菌門的總豐度均超過了50%，說明放線菌門和變形菌門在實驗土壤中是主要優勢類群。到后期時，對照組土壤中的放線菌門豐度大幅度降低，而變形菌門豐度卻大幅度提高，兩者豐度總量輕微下降，其他3 個處理組在兩個菌門豐度上變化趨勢也與之相似，但變化程度沒有對照組大，且豐度總量始終小于對照組?？梢钥吹?，對于其它菌門來說，在任何一個時間內，3 個處理組豐度明顯高于對照組，且10 mL 菌劑處理組在第50 天時的混合土樣中，除上述兩菌門外的菌門總豐度超過了40%。在所有樣本中平均豐度第3～12 名的菌門分別為綠彎菌門（Chloroflexi）、 擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞桿菌門（Gemmatiomonadota）、髕骨細菌門（Patescibacteria）、粘球菌門（Myxococcota）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcota）、藍細菌（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、蛭弧菌門Bdellovibrionota。相比對照組，3 個處理組中綠彎菌門和擬桿菌門的含量要明顯更高，隨著時間變化，各處理組中這兩個菌門總含量逐漸增多。4 個處理組隨著時間變化，各自樣本中厚壁菌門的含量均呈逐漸下降的狀態，但處理組含量始終高于對照組，且在第0 天時，各處理組中厚壁菌門含量的排名為W2>W1>W0>CK（見圖3）。對于芽單胞桿菌門、髕骨細菌門、粘球菌門、異常球菌-棲熱菌門這4 個菌門，在處理組的含量均高于對照組。對照組在3 個時期的藍細菌含量要明顯多于其他3 個處理組，且對照組隨著時間變化，藍細菌含量也逐漸升高。對于放線菌門和Bdellovibrionota這兩個菌門，在4 個分組中含量相對較少，且兩個菌門的最大含量分別出現在對照組的第25 天和第50天的土壤樣品中。對于被歸為其他的類群，在4 個分組中隨著時間進程，豐度均呈現增加的狀態。

圖3 門水平上的VENN 圖

從VENN 圖中，能夠清楚地看到不同處理組在不同時間下的菌門種類數量、共同含有的菌門和獨有菌門?？梢钥吹?，對照組在0～25 d 含有的菌門總數沒有變化，25～50 d 增加了2 個菌門；W0 組在0～25 d 含有的菌門總數也沒有變化，25～50 d 只增加了1 個菌門；W1 組在0～25 d 含有的菌門總數增加了5 種，但是25～50 d 沒有變化；W2 組在兩個階段分別增加了5 個菌門和3 個菌門，成為菌門數數量最多的組。整個時間進程里，4 個處理組的共有菌門數從16 個增加到了19 個，說明可能是種植小白菜帶來的共同改變。但是觀察4 個處理組的特有菌門發現，只有對照組的獨有菌門數量最多，且到后期增加到4 個菌門，分別是GAL15、迷蹤菌門（Elusimicrobiota）、梭桿菌門（Fusobacteriota）和硝化螺旋菌門（Nitrospirota），W0 組最后的獨有菌門是Hydrothermae，而W1 和W2 組最終沒有獨有的菌門。

為了解樣本間的細菌群落Beta 多樣性差異，對4 個處理組的12 個樣本，在3 個時間點上，分別進行OTU 水平上的PCA 分析，結果如圖4 所示。

圖4 OTU 水平上的PCA 分析

由PCA 分析結果圖可以清楚地看到，無論在哪個種植期，對照組與3 個處理組之間在OTU 水平上的物種組成差異顯著。根據12 個樣本在圖中的象限分布可知，只要使用了保水劑和有機肥的土壤在同一種植時間的土壤細菌多樣性沒有顯著差異，但3個有改良材料的處理組在初始第0 天的土壤細菌多樣性明顯與后期的不同，25 d 和50 d 的區別不明顯，說明隨著種植時間的增長，土壤微生物環境發生了變化。

綜上可知，保水劑與有機肥的使用能顯著改變土壤微生物環境，且隨著時間的推移能夠發生進一步改變，但是微生物菌劑的兩個用量帶來的影響不顯著。

2.4 土壤微生物與6 種土壤酶活的關聯性分析

從圖5 中可以明顯看出，只存在與土壤過氧化氫酶酶活有顯著負相關性的菌門——裝甲菌門（0.05 顯著水平），由此可推測，因為對照組中高豐度的裝甲菌門導致其過氧化氫酶酶活整體顯著低于處理組。土壤纖維素酶酶活不受這15 種菌門影響，同樣也驗證了是否添加保水劑和有機肥對其沒有影響。與土壤脲酶酶活有顯著正相關性的菌門，只有擬桿菌門（0.05 顯著水平）和熱脫硫桿菌門（0.1 顯著水平），相反有顯著負相關性的菌門有藍細菌門（0.05顯著水平）、裝甲菌門、硝化螺旋菌門和變形菌門（0.1 顯著水平）。推測是對照組中低豐度的擬桿菌門以及高豐度的藍細菌門、變形菌門、裝甲菌門、硝化螺旋菌門導致其脲酶活性整體顯著低于處理組。第25 天時，使用菌劑組的脲酶酶活顯著高于不使用組的原因可能是使用組的熱脫硫桿菌豐度更高。與土壤蔗糖酶酶活有顯著正相關性的菌門，分別是擬桿菌門和厚壁菌門（0.05 顯著水平），有顯著負相關性的菌門有藍細菌門（0.01 顯著水平）、裝甲菌門（0.05顯著水平）和蛭弧菌門（0.1 顯著水平）。推測是對照組中低豐度的擬桿菌門、厚壁菌門以及高豐度的藍細菌門、裝甲菌門、蛭弧菌門導致其蔗糖酶酶活整體顯著低于處理組。與土壤堿性蛋白酶酶活有顯著正相關性的菌門，分別是蛭弧菌門（0.05 顯著水平）、裝甲菌門、棲熱菌門和酸桿菌門（0.1 顯著水平），而有顯著負相關性的菌門是放線菌門（0.1 顯著水平）。推測主要是因為隨時間變化，各分組土壤中的蛭弧菌門豐度均升高導致各分組的堿性蛋白酶活性升高。與土壤堿性磷酸酶酶活有顯著正相關性的菌門，分別是綠彎菌門、浮霉菌門（0.01 顯著水平），粘球菌門、Sumerlaeota（0.05 顯著水平），棲熱菌門、疣微菌門、芽單胞桿菌門、髕骨細菌門（0.1 顯著水平），相反，有顯著負相關性的菌門只有硝化螺旋菌門（0.1顯著水平）。推測是對照組中低豐度的綠彎菌門、芽單胞桿菌門、粘球菌門、棲熱菌門、疣微菌門、髕骨細菌門以及高豐度的硝化螺旋菌門導致其速效鉀含量顯著低于處理組。

圖5 基于門水平的物種與土壤酶活性關系熱圖

3 討論

實驗結果顯示，堿性蛋白酶酶活只隨著種植時間進程而逐漸升高，并不受土壤調理劑添加的影響，推測可能是小白菜根系分泌物影響了其活性，而微生物菌劑的使用并沒有使其他種類的酶活性發生顯著變化。以往的許多研究表明，微生物菌劑的使用能夠影響土壤酶的活性。例如宋以玲等[12]研究發現，在種植棉花的土壤中分別使用滅菌和常規的復合微生物菌劑會對土壤性質、微生物環境以及棉花的生長發育情況帶來不同程度的效果，但整體上來看，兩種菌劑的使用都能提高土壤脲酶和蔗糖酶的活性，此外菌劑用量的變化對土壤不同酶活性的影響也有差別。借此推測，可能是本實驗使用的菌劑產品不適合使用的土壤，但其中的具體原因還需對菌劑的成分進行研究后才能決斷。針對過氧化氫酶、纖維素酶以及過氧化氫酶酶活隨時間呈現先升高后降低的規律，推測可能是受土壤微生物環境的影響，也可能受土壤pH 或者養分的影響。對此，前人也進行了大量研究，但結果并不相同。有研究[13]發現，土壤酶活性與土壤有機質含量相關，但與土壤有效磷、速效鉀等養分間并不存在顯著相關，也有研究[14]認為土壤微生物數量與土壤肥力具有顯著的相關性，微生物數量的增多能夠改善土壤結構，從而促使養分循環速率，而土壤酶活性的升高也常伴隨著土壤熟化程度的提高。本實驗中還能看到蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶和纖維素酶的活性在有保水劑和有機肥的處理下明顯要高于對照組，只能說明這兩種改良材料的實驗用量組合添加相比對照組對這幾種酶的活性具有提高作用。如果想知道每種酶活性具體受哪種材料的影響以及用量的影響，還需要進一步實驗分析。

一般認為，微生物群落多樣性水平高的土壤擁有更強的抗逆能力，本實驗中所有處理組隨時間而增加的土壤微生物群落豐富度和多樣性，不但說明小白菜根系的生長發育為土壤微生物環境帶來改變，使土壤質量向良好方向發展，同時也驗證了以往研究中植物在生長過程中會對土壤微生物群落產生影響的結論。也有許多研究[15-16]表明，植物類型不同，對土壤微生物環境帶來的影響也會不同。關于保水劑對土壤微生物環境的影響研究也有很多，沈穎[17]的研究結果表明，其所使用的保水劑對土壤細菌群落沒有顯著影響。本研究中的保水劑種類及用量是否起到了顯著提升土壤微生物群落多樣性還有待于進一步的實驗分析確定。

本研究發現，擬桿菌門豐度增加與土壤過氧化氫酶、蔗糖酶活性的提高具有相關性；綠彎菌門豐度的增加起到了提高土壤堿性磷酸酶活性的作用；厚壁菌門豐度的增加有起到提高蔗糖酶活性的作用；粘球菌門豐度的增加起到了提高土壤堿性磷酸酶活性的作用；單胞桿菌門豐度的增加起到了提高堿性磷酸酶活性的作用；變形菌門是土壤細菌中的最大一門，在多種類型土壤中的豐度都較高，有研究認為變形菌門對重金屬有較好的耐受力[8]，本實驗中變形菌門豐度的提升起到了降低土壤脲酶活性的作用；經研究，藍細菌門大多具有固氮作用，而實驗結果證明，藍細菌門豐度增加主要起到了降低土壤脲酶、蔗糖酶活性的作用；蛭弧菌門豐度的提升起到了提高堿性蛋白酶活性的作用；裝甲菌門豐度的提升起到了降低土壤過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶活性的作用。硝化螺旋菌門豐度提升起到了降低脲酶、堿性磷酸酶活性的作用。而土壤堿性磷酸酶活性的提高也受熱脫硫桿菌、棲熱菌門、疣微菌門和髕骨細菌門豐度增大的影響。

4 結論

使用由保水劑、有機肥和微生物菌劑制成的土壤調理劑能夠提高土壤過氧化氫酶、纖維素酶、蔗糖酶、脲酶和土壤堿性磷酸酶的活性。土壤微生物群落豐富度和多樣性隨著小白菜種植時間進程均有提升，使用土壤調理劑的土壤能夠實現更高的土壤細菌群落豐富度和多樣性，土壤中的優勢菌門始終是放線菌門和變形菌門，提升土壤酶活性的菌門有擬桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、粘球菌門和芽單胞桿菌門，起到與之相反作用的有變形菌門、藍細菌門、蛭弧菌門、裝甲菌門和硝化螺旋菌門。