銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的增殖效果研究

顧煒煒，巴金娜，鄭守晶，鄭明鋒

1.福建農林大學金山學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002

人體腸道內有大量的微生物菌群，有許多不同的菌株。其中，占細菌總數99%以上的是專性厭氧菌，屬于腸道中的優勢菌群，類桿菌和雙歧桿菌占專性厭氧菌的90%以上[1]。腸道微生物在營養物質的消化和吸收中起著重要的作用，參與了糖和蛋白質的代謝過程，促進了人體免疫系統的建立[2]。

銀耳是一種生長于枯木上的膠質真菌[3]，銀耳多糖是銀耳中最重要的活性物質，其含量為60%～70%，尤其是酸性多糖的含量較高[4]。暴悅梅等[5]的實驗研究發現，銀耳中提取的銀耳多糖無甜味，易溶于熱水。

本文從銀耳多糖對嗜酸乳桿菌生長過程的多個影響因素出發，探索銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的增殖效果，了解銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的細胞形態和完整度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），福建農大食品安全科技有限公司；銀耳多糖（Tremella polysaccharide），西安圣青生物科技有限公司；MRS培養基所用試劑及其他試劑皆為國產分析純。

銀耳多糖液體培養基：在MRS 液體培養基的基礎上，將葡萄糖分別換成0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的銀耳多糖，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min。

銀耳多糖固體培養基：在銀耳多糖MRS 液體培養基的基礎上，添加瓊脂粉18 g。

1.2 儀器設備

NS-502CT 光學顯微鏡，東莞奈斯精密儀器有限公司；SPX-70B 恒溫培養箱、DGL-35B 立式高壓蒸汽滅菌鍋、DDS-307 電導率儀、pH-3E 酸度計，力辰科技；U-T6 可見分光光度計，屹譜儀器；2.5 L 厭氧培養袋、2.5 L 立式厭氧產氣袋，海博生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的分離純化

無菌條件下，穿刺挑取一環菌粉，接種到MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養24～48 h。取上述菌懸液在平板上進行劃線法接種，于37 ℃恒溫培養箱中倒置厭氧培養48 h。挑取培養較好的菌落于MRS 液體培養基中進行純化培養24 h。將純化培養后的菌懸液與甘油按照1∶1 的比例混合后保存到菌種保藏管中，在-20 ℃環境下保存。

1.3.2 菌種的活化

取保存在菌種保藏管中的菌種接種到裝有MRS 液體培養基的錐形瓶中，于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養24～48 h。

1.3.3 嗜酸乳桿菌發酵液電導率的測定

微生物細胞里的細胞質物質可以用電導率直觀地表現出來，發酵液電導率的檢測可以直接明了地觀察出菌落細胞的完整性。

取活化后的菌液，以1 %的接種量分別接種到葡萄糖和不同體積分數（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）的銀耳多糖液體培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養24 h。測定兩種不同碳源的嗜酸乳桿菌發酵液的電導率，觀察嗜酸乳桿菌的細胞完整性。

1.3.4 嗜酸乳桿菌細胞結構的觀察

取活化后的菌液，同1.3.3 中的方法培養。培養后的菌液在4 ℃、8 600 r/min 的條件下，離心10 min，在載玻片上用革蘭氏陽性菌染液染色涂布固定，用光學顯微鏡觀察菌體的細胞形態，對不同碳源培養的嗜酸乳桿菌形態進行比較，觀察銀耳多糖對嗜酸乳桿菌細胞形態的影響。

1.3.5 嗜酸乳桿菌生長曲線的測定[6]

取活化后的菌液，同1.3.3 中的方法培養48 h，每隔4 h 取5 mL 菌液，測定嗜酸乳桿菌的OD600nm值，繪制生長曲線。

1.3.6 嗜酸乳桿菌的活菌數測定

取活化后的菌液，同1.3.3 中的方法培養。將培養好的菌液進行梯度稀釋，將合適梯度（10-14、10-15、10-16）菌液用傾注法接種到平板上，每個梯度3 個平行，于37 ℃恒溫培養箱中倒置厭氧培養72 h，進行平板計數統計菌落總數。

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌細胞完整性的影響

由表1、表2 可知，不同碳源培養的嗜酸乳桿菌發酵液的電導率差別不大，因此利用銀耳多糖為碳源培養嗜酸乳桿菌不會破壞細胞的完整性。

表1 不同碳源培養的菌液電導率

表2 嗜酸乳桿菌發酵液電導率的方差分析表

2.2 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌細胞結構變化的影響

用光學顯微鏡觀察不同碳源培養的嗜酸乳桿菌株，以葡萄糖為碳源培養的嗜酸乳桿菌的細胞結構和以不同體積分數銀耳多糖為碳源培養的菌體細胞結構形態沒有區別，由此可得出銀耳多糖為碳源對嗜酸乳桿菌的細胞形態沒有影響。

2.3 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌生長曲線測定的影響

由圖1 可知，嗜酸乳桿菌在0～16 h 內生長緩慢，16～36 h 之間嗜酸乳桿菌的生長速度較快，36 h之后其生長速度趨于平緩。其中，嗜酸乳桿菌在0.8%體積分數的銀耳多糖中生長最快。且由表3 可知，嗜酸乳桿菌在銀耳多糖不同體積分數及不同培養時間中的生長曲線差異極其顯著（P≤0.01），因此選擇0.8%體積分數的銀耳多糖作為碳源。

圖1 不同體積分數銀耳多糖為碳源的嗜酸乳桿菌的生長曲線

表3 不同體積分數銀耳多糖培養菌種的生長曲線的方差分析表

2.4 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌活菌數變化的影響

活菌計數試驗結果顯示：嗜酸乳桿菌在0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的銀耳多糖中生長，對應的活菌數分別為1.3×1017CFU/mL、1.75×1017CFU/mL、1.04 ×1017CFU/mL、4.05 ×1017CFU/mL、3.15 ×1017CFU/mL；不同體積分數間的活菌數差異極其顯著（P<0.01），如表4 所示；且由表5 可知，在5%顯著水平下，活菌數在0.8%體積分數時與其他體積分數存在顯著差異。因此，0.8%銀耳多糖體積分數對嗜酸乳桿菌的增殖效果最好。

表4 不同體積分數銀耳多糖培養菌種的菌落總數方差分析表

表5 不同體積分數間菌種的菌落總數多重比較（Duncan 多重比較）

3 結論

通過電導率的測定及光學顯微鏡觀察可得出，用不同碳源培養的菌株細胞完整性和細胞結構幾乎相同，說明銀耳多糖對嗜酸乳桿菌沒有毒害作用。通過OD600值的變化可知，不同體積分數碳源的嗜酸乳桿菌在0～16 h 內生長緩慢，在16～36 h 間生長飛快，36 h 之后生長速度減慢基本趨于平緩。其中，在0.8%體積分數的銀耳多糖中嗜酸乳桿菌生長最快。通過對嗜酸乳桿菌的活菌數分析可知，在0.8%銀耳多糖中培養的嗜酸乳桿菌的活菌數最多，對嗜酸乳桿菌的增殖效果最好。

結合對嗜酸乳桿菌的電導率、細胞形態結構、生長曲線、菌落總數等的測定，可以得出銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的生長有增殖效果，且嗜酸乳桿菌利用銀耳多糖的最適體積分數為0.8%。