同步硝化反硝化菌處理高氨氮污水脫氮研究

唐素琴，郭婷婷，李一鑫，柯 霞*，薛亞平

1.杭州環境集團，浙江 杭州 310022；2.浙江工業大學生物工程學院，浙江 杭州 310014

隨著我國城市化進程的加快，地下水和地表水受到來自多種途徑的氮污染[1]。含有高濃度氮的廢水排放到水體中，包括湖泊和河流在內，造成了嚴重的環境問題[2]。生物法是一種高效、經濟的脫氮方法，已廣泛應用于實際的污水處理中[3]。微生物技術本質上是借助微生物的代謝過程，強化對有機物質的高效率分解，促使其轉變為無機物，提高污水處理的質量和效率[4]。

作為首個被鑒定的同步硝化反硝化（Simultaneous nitrification aerobic denitrification，SND）細菌，Thiosphaera pantotropha（現命名為Paracoccus denitricans），為微生物連續脫氮工藝提供了新思路[5]。研究表明，隨著時間推移，反硝化菌在好氧培養中會失去反硝化能力，異養硝化-反硝化組合是不同氧可利用度下的適應機制[6]。目前已經分離出大量能夠進行SND 的細菌種屬，如Acinetobacter sp.[7-8]，Aeromonas sp.[9]，Pseudomonas sp.[10-12]，Bacillus sp.[13-15]，Halomonas sp.[16-17]，Ochrobactrum anthropi[18]，Rhodococcus sp.[19]等。

高通量測序技術能夠客觀揭示環境微生物的群落結構、多樣性及其進化關系。隨著技術日趨成熟，利用該技術可以探索出污水處理系統覆蓋功能菌篩選的新方法，極大地拓展功能微生物工程的應用前景[20]。

本研究基于高通量測序技術，分析了某污水廠處理系統不同工段物種豐富度和微生物多樣性，為研究污水系統功能菌群提供了理論基礎。從活性污泥中篩選得到一株具有同步硝化反硝化功能的菌株，命名為康德拉氏副球菌并對該菌株進行16S rDNA 分析、系統發育樹分類鑒定和脫氮功能表征，最后將菌株應用于污水并驗證實際污水處理效果。本研究的開展豐富了微生物菌種資源，為含氮廢水的高效生物脫氮提供了思路借鑒和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及培養基制備

樣品取自杭州某污水處理場，保存于-80 ℃冰箱。污水處理工段取樣及其編號見下表1。

表1 污水處理工段取樣及其編號

培養基的制備：

篩選分離培養基：（NH4）2SO40.47 g，K2HPO4·3H2O 6.5 g，NaH2PO41.5 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO35 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，H2O 1 000 mL；

同步硝化反硝化培養基（Simultaneous nitrification aerobic denitrification medium，SND）：（NH4）2SO42.35 g，C4H4Na2O433.76 g，MgSO40.1 g，KH2PO41.5 g，K2HPO4·3H2O 6.5 g，微量元素溶液20 mL，H2O 1 000 mL；

LB 培養基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 mL。

其中微量元素溶液包括：EDTA 50 g，ZnSO44.4 g，CaCl25.0 g，MnCl2·4H2O 10.2 g，FeSO4·7H2O 10.0 g，（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.2 g，CuSO4·5H2O 3.2 g，CoCl2·6H2O 3.2 g，H2O 1 000 mL。

上述兩種培養基的固體培養基需加入20 g 瓊脂粉，H2O 1 000 mL，pH 為7.0。所有培養基均121℃，20 min 滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選

從杭州某污水處理廠的活性污泥中取樣，用倍比稀釋法制成濃度梯度分別為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的混合液；取不同濃度梯度的混合液100 μL 通過涂布棒接種在篩選培養基平板上，30 ℃培養數天；通過菌落顏色、大小、形狀來判斷并進行單菌劃線分離，平板劃線3 次以獲得純種菌落；將菌液接入到甘油管，-80 ℃保藏。

1.2.2 Illumina Hiseq DNA 測序

對不同工段污水全基因DNA 進行提取。PCR反應體系50 μL：25 μL 采用的高保真酶為Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer。各3 μL（10 μM）前后F/R 引物。10 μL DNA 模板6μL ddH2O 。配置好的PCR 體系按照如下反應條件進行PCR 擴增：預變性98 °C 30s，進行25 個循環：變性98 °C 15 s 退火58 °C 15 s 延伸72 °C 15 s。終延伸72 °C 1 min。PCR 產物用AMPure XP Beads（Beckman Coulter，Indianapolis，IN）純化，并且使用PicoGreen dsDNAAssay Kit （Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）進行量化。

在Illumina HiSeq 2500 上進行測序，對兩端測序進行組合，利用Overlap 將數據進行質控、嵌合體過濾，獲得高質量的Clean Data。構建類OTU（Operational Taxonomic Units），并進行分類注釋。利用QIIME2 軟件計算物種豐富度指數（Chao1）和多樣性指數（Shannon 和Simpson）。測序由杭州擎科生物公司進行。

1.2.3 菌株的形態和生理生化鑒定

SEM 觀察：將菌株在LB 培養基中擴大培養36 h，取1.5 mL 菌液，于6 000 r/min 離心5 min，倒掉上清液。加入2 mL 在4 ℃下預冷的2.5%戊二醛溶液，固定24 h 之后通過掃描電鏡（HATACHI SU 8010，Japan）觀察菌株細胞形態。

1.2.4 16S rDNA 同源性比較

采用常規細菌總DNA 提取法，以基因組DNA為模板擴增16S rDNA，擴增采用的引物為通用引物。正向引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，引物由北京擎科生物科技有限公司（杭州）提供。采用50 μL 反應體系，程序如下：94 ℃5 min，94 ℃1 min，55 ℃40 s，72 ℃2 min，循環35 次；72 ℃15 min。測序由北京擎科生物科技有限公司（杭州）完成，測序結果提交NCBI，并進行BLAST 分析。

1.2.5 菌株ZJB21134 的脫氮曲線及生長趨勢測定

將菌株以10%的接種量分別接種于裝有100 mL 液體異養硝化培養基和同步硝化好氧反硝化培養基的250 mL 錐形瓶中，設置初始氨氮質量濃度為500 mg/L，30 ℃，160 r/min 恒溫搖床培養，每隔一定時間取樣，檢測培養液中氨氮、亞硝氮、硝氮的含量及菌體細胞密度（OD600），得到菌株脫氮曲線和細菌濃度隨時間變化的趨勢圖。

1.2.6 菌株在實際污水中的應用

為了檢測菌株的實際脫氮應用效果，從杭州某污水處理廠采集污水水樣作為供試水樣，污水相關指標如表2 所示。將采集的污水水樣離心后采用絮凝沉淀法進行水樣預處理，具體步驟為向水樣中加入適量硫酸鋅并加入氫氧化鈉，生成氫氧化鋅，過濾去除顏色和渾濁。按照接種量為2%，碳源為蔗糖，C/N 為15，pH 為7.0 的條件于30 ℃，160 r/min 搖床震蕩培養，測定不同時間段氨氮、硝氮、亞硝氮、總氮的含量。取不加菌株的污水樣品為對照組。

表2 污水相關指標

1.2.7 分析方法及計算

圖形的繪制使用GraphPad Prism 8.0。

硝酸鹽測定：鹽酸紫外分光光度法[21]。

亞硝酸鹽測定：N-（1-萘基）-乙二胺光度法[22]。

氨氮測定：水楊酸-次氯酸鹽分光光度法[23-24]。

pH：用pH 計（梅特勒托利多，中國）測定。

2 結果和分析

2.1 不同處理工段微生物群落結構分析

2.1.1 所有樣本細菌多樣性測序分析

經過16s rDNA 擴增子焦磷酸測序，10 個樣本共獲得1 271 782 個有效序列，各樣本分析結果見表3。不同樣品測序結果存在差異：序列數量最大值為A 樣品（132 316 條），最小值為F 樣品（119 224條）。Ace 指數、Chao 指數用來估計群落中含OTU 數目的指數，常用以估計物種總數。Shannon 指數和Simpson 指數用來估算樣品中微生物的多樣性指數。Alpha 分析結果顯示，ATBC 生物轉盤相比曝氣池和沉淀池具有較高水平的OTUs、Ace 指數、Chao1指數和Shannon 指數，表明其群落豐富度較高。

表3 不同處理工段微生物細菌群落Alpha 分析結果表

2.2.2 不同處理工段樣本門水平菌群結構分析

如圖1 所示，所有樣本門水平菌群結構中，變形桿菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，其次為厚壁門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidetes）和暖發菌門（Caldithrix）， 此外還有少量浮霉菌門（Planctomycetes），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌門（Chloroflexi）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。

圖1 所有樣本門水平菌群構成比例

一期ATBC 出水、ATBC/B 和D 轉樣品門水平菌群比例見圖2，其中均含有較高水平的變形桿菌門。此外，一期ATBC 出水樣品具有少量的綠彎菌門；ATBC/B 區樣品中具有少量擬桿菌門；D 轉樣品中具有少量的暖發菌門及綠彎菌門，還存在極少量厚壁門。一期進水樣品中，厚壁門相對豐度最高，擬桿菌門次之，此外還有部分變形桿菌門；曝氣池和沉淀池樣品門水平菌群比例見圖3、圖4，其中都具有較高豐度的變形桿菌門。處理系統從進水的優勢菌門厚壁門轉變為變形桿菌門，從進水到出水，厚壁門的相對豐度降低了31.3%。變形桿菌門在污水處理系統中最為常見，一些能夠降解有機物、氮和芳香烴的功能屬于變形菌門[25]。擬桿菌門參與聚合物和復雜有機物質的降解，可以將包含多糖和蛋白質的死細胞分解為簡單的有機分子（如乙醇和乳酸），這些簡單的分子可以被其他物種代謝。綠彎菌門可以合成胞外多糖，對污泥團聚體的形成起著重要作用，并可通過絲狀網絡增強生物膜的結構[26]。

圖2 ATBC 生物轉盤樣品門水平菌群比例

圖3 生化曝氣池樣品門水平菌群比例

圖4 沉淀池樣品門水平菌群比例

2.2.3 不同工段屬水平菌群組成

不同工段屬水平菌群相對豐度圖見圖5 所示，可見ATBC 生物轉盤、生化曝氣池、沉淀池處理工段的優勢菌屬為陶厄氏菌屬（Thauera sp.），說明陶厄氏菌屬更容易在高氨氮體系中生存并富集。陶厄氏菌屬是污水處理系統中檢測到的主要反硝化細菌。有學者發現，Thauera aminoaromatica 是消耗乙酸鹽、積累聚羥基丁酸酯和硝酸鹽還原的主要菌株，通過三羧酸循環產生的能量，主要用于內源聚β-羥基丁酸酯合成和硝酸鹽還原[27]。

圖5 不同工段屬水平菌群相對豐度圖

2.2.4 菌株的篩選

分離得到35 株菌株，經脫氮培養基進行功能表征后，確定菌株ZJB21134 為本研究篩選出的高效反硝化菌株。

2.2.5 菌株的形態鑒定和生理生化鑒定

菌株ZJB21134 的菌落（見圖6）形態特征為圓形、粉紅色、較小、表面濕潤光滑、邊緣整齊、緊貼在培養基表面、易挑取，且該菌株為橢圓棒狀細菌，無鞭毛和芽孢。通過稀釋涂布法得知，菌株在對數增長期的菌落數為7.5×108CFU（Colony-Forming Unit），表明菌株生長狀態良好，生物活性高。

圖6 菌株ZJB21134 的培養皿照片（a）、掃描電鏡（SEM）照片（b）

將測得菌株ZJB21134 的16S rDNA 序列在NCBI-nucleotide 數據庫中進行比對，發現菌株ZJB21134 與康德拉氏副球菌（Paracoccus kondratievae）的同源性為99%。采用MEGA7.0 軟件進行多重序列比對后，構建鄰接法（N-J 法）系統發育樹，Bootstrap 自展檢測1000，構建出的系統發育樹如圖7 所示，菌株ZJB21134 與康德拉氏副球菌（Paracoccus kondratievae）的親緣關系最為接近，推測菌株ZJB21134 屬于副球菌屬（Paracoccus sp.），為康德拉氏副球菌（Paracoccus kondratievae）。

圖7 利用Neighbor-Joining 構建的16S rDNA 系統發育進化樹

2.2.6 菌株ZJB21134 異養硝化好氧反硝化試驗

在好氧條件下，以丁二酸鈉為唯一碳源，C/N=10，菌液初始投加量為10%（V/V），初始氨氮質量濃度為500 mg/L 時，培養液中氨氮、硝氮、亞硝氮的含量變化及菌株在培養條件下的生長情況，如圖8 顯示。隨著菌株生長量的增加，24 h 內氨氮基本降解，終質量濃度為20.38 mg/L，脫除率達到99.91%；同時未產生硝氮和亞硝氮積累，可以看到，整個脫氮過程處于菌體生長的對數增長期，說明菌體是在自身生長和代謝的過程中脫除氮素，不產生二次污染。總氮在24 h 時降到最低值，為63.32mg/L，總氮去除率為86.74%。

圖8 脫氮處理進程菌株ZJB21134 生長量（OD600）、氨氮濃度、硝氮濃度和亞硝氮濃度的變化

2.2.7 菌株ZJB21134 對實際污水的處理效果

圖9 為菌株ZJB21134 實際污水的處理效果，對照組為不加菌液的污水水樣，在整個過程中，總氮、氨氮的含量都略有降低，但是降解效果不明顯。期間具有一定的降解效果，可能是由于污水本身自帶的菌能夠進行同化作用去除氮素。添加了菌ZJB21134 的實驗組處理后氨氮質量濃度從226.50 mg/L 降低到25.44 mg/L，氮的去除率為88.77%；硝氮質量濃度從78.35 mg/L 降低到10.70 mg/L，氮的去除率為86.35%；總氮質量濃度從565.12 mg/L 降低到222.04 mg/L，氮的去除率為60.70%；且未生成亞硝酸鹽的積累。實驗結果說明，菌株ZJB21134 的添加（2%接種量）能夠在一定程度上提高污水中的氮素降解效果。

圖9 菌株ZJB21134 在實際污水中的脫氮效果

3 結論

本研究基于高通量測序技術分析了污水處理系統中的微生物多樣性，對未來進一步探討脫氮機理有很大的參考價值。結果顯示，脫氮系統具有豐富的群落多樣性，污水處理系統從進水的優勢菌門厚壁門（Firmicutes）轉變為變形桿菌門（Proteobacteria），主要優勢菌屬為陶厄氏菌屬（Thauera）。變形桿菌門是污水處理廠中最主要的微生物群，對于高氮含量的垃圾滲濾液來說，該菌門在碳氮去除方面發揮著重要的作用[28]。

本文從活性污泥中篩選得到1 株同步硝化好氧反硝化細菌ZJB21134，對其進行系統表征，鑒定為康德拉氏副球菌（Paracoccus kondratievae）。該菌株具有較強的脫氮能力，24 h 內對初始質量濃度為500 mg/L 氨氮的去除率為99.91%，且未產生硝氮和亞硝氮的積累。利用菌株處理氨氮質量濃度為100 mg/L 的實際污水，總氮、氨氮、硝氮脫除率分別為60.70%，88.77%和86.35%。以上結果表明，菌株ZJB21134 是一種高效的同步硝化反硝化細菌，在城市高氨氮廢水生物處理工藝中具有良好的應用前景。