低劑量攝入不同香型白酒對2型糖尿病小鼠的影響

張玉超，劉良禹，朱思潔，楊 旭，黃順琴，王 澳，劉旭東*

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507；2.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266100；3.茅臺學院 食品科學與工程系，貴州 遵義 564507；4.華中師范大學 生命科學學院，湖北 武漢 430079）

白酒作為世界三大蒸餾酒之一，在我國有著廣泛的消費，2019年在我國食品工業主營收入中白酒產業占6.92%的份額[1]。作為我國的傳統酒類，同時又是傳統文化的典型代表，多年來有關白酒的風味研究從未停止[2]。然而隨著人民生活水平的不斷提高，健康飲食的觀念不斷深入人心，飲酒的健康效應也逐漸受到研究人員的關注。

糖尿病作為一個世界性的公共衛生問題，目前已被認為是僅次于惡性腫瘤和心腦血管疾病的第三大威脅人類健康的疾病[3]。有研究顯示，一定量的啤酒、葡萄酒、烈性酒攝入對于2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）病癥有一定的緩解作用[4]。國內外均有流行病學研究表明，飲酒量和T2DM患病風險之間呈U型關系[5-7]。已有研究顯示，在較低的酒精攝入劑量下（10 g/d），飲酒會降低T2DM患病風險，而當酒精攝入量超過10 g/d后，T2DM患病風險會隨著攝入量的增大而升高，提示10 g/d的酒精攝入劑量可能是飲酒與T2DM之間U型關系的劑量拐點[8]。而本團隊的前期研究發現，按人群10 g/d的酒精攝入劑量與小鼠給藥劑量進行等效換算，對小鼠進行低劑量的酒精攝入會加重T2DM雄性小鼠的病癥[9]。

本文的前期研究結果已經說明單純的酒精攝入可對T2DM產生影響，而單純的酒精攝入并不能完全等同于飲酒。酒類中除了水和酒精以外還有很多其他成分，白酒中的微量成分超過2 000種，其中有200多種成分已被證明對健康有益[10-11]。由于原料及生產工藝條件的不同，使得不同香型白酒的風味成分也存在著顯著差異。又鑒于飲酒與T2DM發生在流行病學研究中體現出的U型相關性，因此進一步探究不同香型白酒攝入尤其是低劑量不同香型白酒攝入對于T2DM的影響，對于未來闡明飲酒于T2DM發生之間的關系則顯得尤為重要。

為更好的了解低劑量攝入不同香型白酒對T2DM的影響，本研究對T2DM小鼠進行不同香型白酒（52度濃香型、52度清香型、53度醬香型）連續30 d灌胃，隨后對小鼠T2DM相關指標進行檢測，并對小鼠肝臟、胰腺組織病理學損傷和胰腺氧化應激、炎癥水平進行分析，以期為未來闡明低劑量攝入不同香型白酒對T2DM的影響提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗小鼠

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性昆明小鼠（6～8周齡，體質量（20±2）g）：湖北省疾病預防控制中心實驗動物研究中心。小鼠飼養于標準實驗動物房內，鼠籠內通入無菌空氣，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h/12 h明暗交替，自由進食飲水。

1.1.2 試劑

高脂高糖飼料：上海集奇生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產分析純。

小鼠總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、胰島素檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒：美國eBioscience公司；核因子NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）檢測試劑盒：上海藍基生物公司。

1.1.3 原料

52度某品牌濃香型白酒、52度某品牌清香型白酒、53度某品牌醬香型白酒均為市售成品白酒。

1.2 儀器與設備

590血糖儀及試紙：江蘇魚躍醫療設備有限公司；FLx800熒光酶標儀：美國Bio-Tek公司；DNM-9602全波長酶標儀：北京普朗新技術有限公司；5424R低溫冷凍離心機：德國Eppendorf公司；DP73顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 T2DM模型的構建

在動物房內對小鼠進行一周的基礎飼料適應性喂養后，隨機選取10只小鼠繼續進行基礎飼料喂養，剩余小鼠更換高脂高糖飼料喂養。參照文獻[9，12]的方法利用高脂高糖飼料喂養結合STZ腹腔注射方式進行小鼠T2DM模型構建，以小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）＞11.1 mol/L視為建模成功。隨機選擇建模成功的小鼠40只進行實驗。

1.3.2 實驗動物分組及飲酒暴露

將實驗動物按表1分為5組，參照文獻[9，13]的方法，以10 g/d的純酒精攝入量作為人群低劑量飲酒標準，進行人與小鼠等效給藥劑量換算后得出52度濃香型白酒、52度清香型白酒、53度醬香型白酒的小鼠日灌胃劑量分別為3.17 mL/kg、3.17 mL/kg、3.11 mL/kg，連續灌胃30 d。

1.3.3 小鼠體質量增長量及飲食飲水量的測定

參照文獻[9，14]，在實驗期間每天記錄小鼠的體質量及飲食飲水量，計算小鼠30 d的體質量增長量和飲食飲水量。

1.3.4 小鼠空腹血糖及糖耐量的測定

參照文獻[15]的方法，在最后一次灌胃暴露后，對小鼠進行禁食不禁水12 h，隨后對小鼠的空腹血糖、口服糖耐量和血糖曲線下面積（area under the curve of blood glucose，AUC）進行測定。

1.3.5 小鼠血脂指標及胰島素含量的測定

最后一次灌胃暴露24 h后，參照試劑盒說明書對小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C及胰島素含量進行測定。

1.3.6 小鼠肝臟和胰腺組織病理學觀察

最后一次酒精暴露結束24 h后，用頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠胰腺組織和肝組織。參照文獻[9]的方法對小鼠肝臟和胰腺組織進行石蠟包埋和切片后，進行蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色，隨后在顯微鏡下進行切片觀察。

1.3.7 小鼠胰腺組織樣品制備及氧化應激、炎癥指標測定

參照文獻[16]的方法對小鼠胰腺組織樣品進行組織勻漿制備，采用DCFH-DA法檢測活性氧（reactive oxygen species，ROS）相對表達量，使用相對熒光強度進行衡量[17]。使用TBA法測定小鼠胰腺組織勻漿上清液中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[17]。按試劑盒說明書測定小鼠胰腺組織勻漿上清液中的GSH、NF-κB、TNF-α、IL-1β含量。

1.3.8 數據處理

采用SPSS 13.0對數據進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）結合Duncan檢驗分析差異性，差異顯著水平是P＜0.05，使用GraphPad Prism 8.0生成數據統計圖。

2 結果與分析

2.1 不同香型白酒對T2DM小鼠體質量、飲食量、飲水量的影響

各組小鼠灌胃30 d后的體質量、飲食量、飲水量變化結果見表2。

表2 各組小鼠體質量、飲食量、飲水量Table 2 Bodyweight, food and water intake of mice in each group

由表2可知，灌胃30 d后只有T2DM組小鼠體質量出現了下降，而低劑量攝入不同香型白酒的T2DM小鼠體質量均出現了少量的增加，但增長量依然顯著低于CK組小鼠（P＜0.05）。飲食量和飲水量的結果顯示，T2DM組小鼠的飲食量和飲水量均顯著高于CK組小鼠（P＜0.05），而低劑量攝入不同香型白酒的T2DM小鼠的飲食量和飲水量與T2DM組小鼠比出現了一定的下降，但依然顯著高于CK組小鼠（P＜0.05）。不同香型白酒對T2DM小鼠在體質量增長量、飲食量、飲水量的影響并未出現顯著性的差異（P＞0.05）。

“三多一少”為糖尿病的典型癥狀，以上結果顯示，建模后T2DM組小鼠出現了飲食多、飲水多，但體質量減少的糖尿病典型癥狀，而低劑量攝入不同香型白酒后可以緩解T2DM小鼠體質量下降、進食和飲水量增加的癥狀，該結果與周振宇等[3]的研究結果一致，但與CK組小鼠相比飲酒組小鼠的高攝食量、高飲水量、低體質量的糖尿病癥狀依然明顯，而不同香型白酒對于T2DM小鼠在以上指標上并未體現出差異性的影響（P＞0.05）。說明低劑量攝入白酒對于T2DM小鼠“三多一少”癥狀有所改善，但改善程度有限。

2.2 不同香型白酒對T2DM小鼠空腹血糖的影響

空腹血糖（FBG）是判斷糖尿病的主要依據，按糖尿病診斷標準，FBG高于11.1 mmol/L則可被視為血糖超標[18]。不同香型白酒對T2DM小鼠FBG的影響結果見圖1。由圖1可知，30 d后CK組小鼠FBG處于正常值范圍，而T2DM組小鼠FBG已遠超建模標準，小鼠FBG的異常升高符合T2DM典型癥狀。與T2DM組小鼠相比，各低劑量白酒攝入組小鼠FBG雖然出現了小幅度的下降，但是依然顯著高于CK組（P＜0.05），同時也高于建模標準。結果顯示，低劑量攝入不同香型白酒可以降低T2DM小鼠的FBG，該結果與周振宇等[3，19]的研究結果類似，可能與低劑量攝入白酒提高了小鼠胰島素分泌量或降低了小鼠胰島素抵抗有關。但是降低程度有限，各組小鼠FBG異常升高的癥狀依然明顯。而不同香型白酒對T2DM小鼠FBG降低的程度并無顯著性差異（P＞0.05）。說明低劑量攝入白酒可緩解T2DM小鼠FBG異常升高，但緩解程度有限。

圖1 各組小鼠空腹血糖測定結果Fig.1 Determination results of fasting blood glucose of mice in each group

2.3 不同香型白酒對T2DM小鼠口服糖耐量的影響

糖耐量是機體對血糖的調節能力，當機體大量攝入葡萄糖后會快速分泌胰島素、合成肝糖原促使體內血糖下降，如胰腺組織無法快速做出反應，那么葡萄糖攝入2 h后都無法回正常值[20]。不同香型白酒對T2DM小鼠血糖濃度變化的影響見圖2。由圖2可知，CK組小鼠的血糖濃度在灌胃葡萄糖0.5 h后內出現了升高，隨后開始出現下降，2 h后已經恢復到原水平。而T2DM組小鼠的血糖濃度則在1 h內持續升高，2 h后雖出現下降，但與原水平相比依然有顯著升高（P＜0.05）。而低劑量攝入不同香型白酒的T2DM小鼠血糖濃度變化趨勢與CK組小鼠類似，2 h后血糖濃度與原水平相比雖然有升高，但升高的程度小于T2DM組小鼠。說明T2DM小鼠對于血糖的調節能力出現了改變，胰腺組織無法快速執行降低血糖的功能糖耐量出現了異常。而低劑量攝入不同香型白酒后可能通過改善胰腺功能，提高胰島素表達加快降低血糖濃度的速率，對T2DM小鼠糖耐量異常的改善有一定的作用，但是改善作用有限，小鼠依然存在糖耐量異常。

圖2 各組小鼠血糖濃度測定結果Fig.2 Determination results of blood glucose concentration of mice in each group

糖耐量曲線下面積可以用來衡量物質改善機體糖耐量異常的能力[21]，不同香型白酒對T2DM小鼠口服糖耐量曲線下面積的影響見圖3。

圖3 各組小鼠血糖曲線下面積測定結果Fig.3 Determination results of blood glucose curve area of mice in each group

由圖3可知，與CK組小鼠相比，T2DM組小鼠AUC顯著性的升高（P＜0.05）。低劑量攝入不同香型白酒后使T2DM小鼠的AUC出現了一定程度的下降，但依然顯著性高于CK組小鼠（P＜0.05），且不同香型白酒對T2DM小鼠AUC的影響并未呈現出差異性。說明低劑量攝入不同香型白酒對T2DM小鼠AUC的異常有一定的改善作用，但程度有限，而不同香型白酒組AUC之間差異不顯著（P＞0.05），說明不同香型白酒T2DM小鼠糖耐量的改善能力無差異。

2.4 不同香型白酒對T2DM小鼠脂代謝相關指標的影響

T2DM通常伴有不同程度的脂代謝紊亂，主要體現在TC、TG、LDL-C含量的升高以及HDL-C含量的下降，血脂含量的異常已經被證明是引起胰島素分泌異常、胰島素受體抵抗的原因之一[22]。各組小鼠灌胃30 d后TC、TG、LDL-C、HDL-C的檢測結果見表3。由表3可知，T2DM組小鼠血清TC含量較CK組小鼠出現了顯著升高（P＜0.05），而低劑量攝入不同香型白酒使得T2DM小鼠血清TC含量出現了一定下降，但是依然顯著高于CK組小鼠（P＜0.05），且飲用不同香型白酒之間并未出現顯著差異（P＞0.05）。各組小鼠血清TG和LDL-C含量的變化情況與TC類似。HDL-C含量檢測結果顯示，T2DM組小鼠血清HDL-C含量出現了顯著下降（P＜0.05），而低劑量攝入不同香型白酒使得T2DM小鼠血清HDL-C出現了一定升高，但依然顯著低于CK組小鼠（P＜0.05）。該研究結果與陳欣怡等[23]的研究結果類似，可能是由于低劑量飲用白酒會改善了高脂高糖飲食導致的腸道菌群失衡，促進了機體脂代謝穩定。而不同香型白酒之間無顯著性差異（P＞0.05）。說明低劑量攝入不同香型白酒對T2DM脂代謝紊亂有一定的調節作用，但作用程度有限且無香型差異。

表3 各組小鼠總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇含量Table 3 Contents of total cholesterol, triglyceride, low density lipoprotein cholesterol, high density lipoprotein cholesterol of mice in each group mmol/L

2.5 不同香型白酒對T2DM小鼠肝組織和胰腺組織的影響

胰島組織結構功能異常是糖尿病發生的主要原因之一，而肝臟也在糖尿病的發生過程中起著重要的作用，如葡萄糖激酶的標達、肝糖原的合成、脂代謝的調節等[24]。不同香型白酒對T2DM小鼠肝組織和胰腺組織的影響結果見圖4。

圖4 各組小鼠肝組織（A）和胰腺組織（B）細胞形態Fig.4 Cell morphology of mice lives tissue (A) and pancreas (B) in each group

由圖4A可知，CK組小鼠肝臟細胞形態正常，未見脂肪性病變和明顯的腫脹或萎縮。T2DM組小鼠肝臟胞體變大，細胞出現明顯的脂肪性病變，細胞大面積集中出現胞質稀疏，胞質內出現大量空泡，結構明顯異常。低劑量攝入不同香型白酒后各組小鼠肝臟細胞胞質稀疏和空泡樣變化雖仍然顯著，但是和T2DM組相比，未見大面積集中性的細胞損傷。說明低劑量攝入不同香型白酒可以緩解T2DM小鼠肝臟損傷，但是緩解程度有限，肝臟損傷依然顯著存在。

由圖4B可知，CK組小鼠胰腺組織中胰島和胰島外周細胞規則、完整，胰島呈清晰的圓形或橢圓形，胰島邊緣明顯，胰島大小正常，胰島內細胞分布均勻。T2DM組小鼠胰島呈不規則形態，內部細胞稀疏、不均勻，胰島邊緣不整。低劑量攝入不同香型白酒后各組小鼠胰島不規則和邊緣不整的情況有所緩解，可見圓形或橢圓形胰島，但胰島內部細胞稀少，胰島形態明顯小于CK組，存在一定的萎縮。說明低劑量攝入不同香型白酒后T2DM小鼠胰島病變有一定的緩解，但胰島內細胞稀少和胰島萎縮依然明顯。

綜上，低劑量飲用白酒可以對于T2DM小鼠肝臟和胰腺的結構異常有一定的改善作用，但是作用程度有限。

2.5 不同香型白酒對T2DM小鼠胰島素水平的影響

不同香型白酒對T2DM小鼠胰島素水平的影響結果見圖5。

圖5 各組小鼠胰島素水平測定結果Fig.5 Determination results of insulin levels of mice in each group

由圖5可知，與CK組小鼠相比，T2DM小鼠胰島素水平出現了顯著下降（P＜0.05），而攝入不同香型白酒使T2DM小鼠胰島素水平顯著上升（P＜0.05），但依然顯著低于CK組小鼠（P＜0.05），且攝入不同香型白酒之間并未出現顯著差異。說明低劑量攝入不同香型白酒有促進胰島素分泌的作用，進而可以緩解T2DM小鼠胰島素水平下降，結果與前期相關研究報道結果相符，可能與低劑量白酒攝入增加了胰島組織血流量有關[25]。但調節程度有限，T2DM小鼠胰島素水平依然顯著低于CK組（P＜0.05）。

2.6 不同香型白酒對T2DM小鼠胰腺組織氧化應激水平的影響

胰腺組織氧化應激已被證明和T2DM的發生發展有著密切的聯系[26]，本團隊前期研究也證明T2DM小鼠胰腺組織氧化應激水平升高，且攝入純酒精后氧化應激水平會進一步提高[9]。但白酒與酒精不同，白酒中酚類物質、部分醛類和多肽類等物質都具有一定的抗氧化作用[27-28]，由于不同香型白酒的組成存在差異，所以對自由基的清除能力也可能不同。各組小鼠胰腺組織氧化應激水平的變化見表4。

表4 各組小鼠胰腺組織活性氧、丙二醛及還原型谷胱甘肽水平Table 4 Reactive oxygen species, malondialdehyde and glutathione levels of mice in each group

由表4可知，與CK組小鼠相比，T2DM小鼠胰腺組織ROS表達量和脂質過氧化物MDA的含量均出現了顯著升高（P＜0.05）。低劑量攝入不同香型白酒使ROS表達量和MDA含量均出現了不同程度的下降，但下降程度有限，依然顯著高于CK組小鼠（P＜0.05）。而攝入不同香型白酒之間出現了差異性，攝入清香型和醬香型白酒后T2DM小鼠ROS表達量和MDA含量的下降程度要大于濃香型白酒。小鼠胰腺組織GSH含量檢測結果顯示，與CK組小鼠相比，T2DM小鼠胰腺組織GSH含量出現了顯著下降（P＜0.05），低劑量攝入不同香型白酒使GSH含量出現了一定的回升，但回升程度有限，依然顯著低于CK組小鼠（P＜0.05）。同時攝入不同香型白酒之間也出現了差異性，攝入清香型和醬香型白酒后T2DM小鼠GSH含量的上升程度要大于濃香型白酒。白酒中富含的抗氧化物質以及不同香型白酒風味物質類型的不同，可能是導致上述結果的原因。

以上結果說明低劑量攝入不同香型白酒對T2DM小鼠胰腺組織氧化應激有一定的調節作用，但調節程度有限，T2DM小鼠胰腺氧化應激依然顯著。而在本研究中清香型和醬香型白酒抗T2DM小鼠胰腺氧化的作用要略大于濃香型白酒。已有研究表明，不同香型白酒均具有一定的自由基清除能力，且清除能力強弱依次為清香、醬香、芝麻香、老白干香、濃香[29]。而本研究的結果也提示清香型和醬香型白酒抗T2DM小鼠胰腺組織氧化應激的能力略大于濃香型白酒。但不同香型白酒抗氧化性的差異并未體現在對T2DM糖脂代謝紊亂的調節作用中，可能是因為雖然不同香型白酒均可下調T2DM小鼠胰腺組織氧化應激水平，但是調節程度有限，調整后飲酒組小鼠胰腺氧化應激仍處于很高的水平，依然導致了小鼠肝臟和胰腺功能的異常，所以不同香型白酒抗氧化性的差異并未體現在對T2DM糖脂代謝功能紊亂的調節上。

2.7 不同香型白酒對T2DM小鼠胰腺組織炎癥水平的影響

根據氧化應激分級模型，細胞中持續高水平的氧化應激會活化炎癥信號通路，相關轉錄因子被激活，炎癥因子表達上調誘導炎癥反應[30]。白酒的抗炎作用研究發現，白酒有機萃取物具有抗炎作用[31]。各組小鼠胰腺組織炎癥水平的變化結果見表5。

表5 各組小鼠胰腺組織的NF-κB、TNF-α和IL-1β水平Table 5 NF-κB, TNF-α and IL-1β levels of pancreatic tissue of mice in each group

由表5可知，與CK組小鼠相比T2DM小鼠胰腺組織轉錄因子NF-κB及其調控轉錄的主要炎癥因子TNF-α和IL-1β[32-33]的含量均顯著升高（P＜0.05），而低劑量攝入不同香型白酒對NF-κB、TNF-α和IL-1β的升高有調節作用，但是調節程度有限，T2DM小鼠胰腺組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β的表達量仍然顯著高于CK組小鼠（P＜0.05），且攝入不同香型白酒差異不顯著（P＞0.05）。說明低劑量攝入白酒對緩解T2DM小鼠胰腺組織炎癥水平有一定的作用，但緩解程度有限，且不同香型白酒的作用無差異。

結合2.6的結果，不同香型的白酒可能是通過降低T2DM小鼠胰腺組織氧化應激水平進而達到緩解胰腺組織炎癥水平的作用。但在調節胰腺組織氧化應激水平的作用上不同香型白酒體現出了一定的差異性，而在調節炎癥水平上并未顯示出差異，可能是由于低劑量攝入不同香型白酒后T2DM小鼠胰腺組織氧化應激水平雖有不同水平下降，但是均仍然處于高水平的氧化應激狀態，均可以促進高水平炎癥反應的發生。因此在本研究中，低劑量攝入不同香型白酒對T2DM小鼠胰腺組織炎癥水平的調節并未顯示出差異性。

3 結論

建模后T2DM小鼠糖脂代謝紊亂，胰島素水平下降，肝臟及胰腺組織出現明顯損傷，胰腺組織氧化應激和炎癥水平上調。而低劑量攝入不同香型白酒，對T2DM小鼠出現的異常均體現出了一定的調節作用，但是調節程度有限，各組小鼠T2DM相關癥狀和損傷依然顯著存在。降低T2DM小鼠胰腺組織氧化應激和炎癥水平可能是低劑量攝入不同香型白酒對T2DM小鼠產生調節作用的主要機制之一。低劑量攝入不同香型白酒對T2DM小鼠的調節作用只在調節小鼠胰腺組織氧化應激水平上體現出了一定的差異，而這種差異對于T2DM小鼠胰腺組織炎癥水平及T2DM相關病癥并未產生影響。后續研究中，可考慮分析不同香型白酒主要差異成分對T2DM的作用，進一步為闡明不同香型白酒對于T2DM的影響提供參考。