PagHK3a 基因敲除對銀腺楊抗旱性的影響

武 舒，王 洲，張明艷，鐘姍辰，王 黎，蘇曉華，張冰玉

(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種全國重點實驗室 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室 北京 100091)

干旱嚴重影響植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量，是導致植物死亡的重要因素之一[1-2]。為適應生存環(huán)境，植物進化出各種響應機制。其中，雙組分系統(tǒng)（Two-component systems，TCS）是植物響應環(huán)境信號的重要通路之一[3]。根據(jù)TCS 組成成分種類以及蛋白結(jié)構(gòu)域的不同，將其分為傳統(tǒng)型和復雜型。傳統(tǒng)型TCS 主要由組氨酸激酶（Histidine kinases，HKs）和響應調(diào)節(jié)因子（Response regulators，RRs）構(gòu)成，而復雜型TCS 往往于兩組分間增添了磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（ Histidine phosphotransfer proteins，HPts）[4]。在植物等真核生物中，細胞信號傳導依賴于后者。TCS 的作用機制在于各組分間的磷酸基團轉(zhuǎn)移。植物通過TCS 感知信號并做出響應的一般流程包括：首先HKs 上的感應結(jié)構(gòu)域接收環(huán)境信號，催化其激酶結(jié)構(gòu)域中的組氨酸殘基（His）發(fā)生自磷酸化，隨后磷酸基團轉(zhuǎn)移至接收結(jié)構(gòu)域內(nèi)的天冬氨酸殘基（Asp）；接著HPts 接受磷酸基團，并將磷酸基團進一步轉(zhuǎn)移至RRs 上的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，隨之激活其效應結(jié)構(gòu)域，從而使植物做出響應[5]。

在擬南芥（Arabidopsisthaliana（ L.）Heynh.）中共鑒定到56 個TCS 相關(guān)基因，其中HKs及相關(guān)基因共17 個，HPts基因6 個，RRs基因33 個[6]。擬南芥組氨酸激酶又可分為AHK、乙烯受體（Ethylene receptors）及光敏色素光感受器（Phytochrome photoreceptors）3 大家族，AtHK1、AtHK2、AtHK3、AtHK4（CRE1/WOL）、AtHK5（CKI2）以及AtCKI1 構(gòu)成了AHK 家族。其中，AtHK2、AtHK3 以及AtCRE1 可感知細胞分裂素信號，被稱為細胞分裂素受體[7-8]。而細胞分裂素的信號傳導過程與植株響應干旱脅迫和調(diào)節(jié)植株脅迫適應性存在密切聯(lián)系[9]。研究表明，PEG 模擬干旱脅迫條件下，擬南芥組氨酸激酶基因突變體ahk3植株根長生長量和植株鮮質(zhì)量均大于野生型[10]；同時ahk2、ahk3突變體株系存活率更高，抗旱性更強[11]。基因表達模式分析表明，磷酸轉(zhuǎn)移蛋白基因AtHP2/3/5在干旱脅迫/鹽脅迫處理后均下調(diào)表達，并且干旱脅迫下ahp2,3,5突變體表現(xiàn)出更高的相對含水量和更低的相對電導率，即細胞膜穩(wěn)定性更強，完整度更高，更加抗旱[12]。與AtHP2/3/5相似，響應調(diào)節(jié)蛋白基因AtRR1/10/12表達水平在干旱或ABA 處理后表現(xiàn)為下調(diào)趨勢。干旱條件下，arr突變體通過維持較高含水量，進而增強抗旱能力[13]。因此,細胞分裂素信號傳導通路各組分在植物響應干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。

楊樹（Populusspp.）是我國重要的生態(tài)防護、綠化建設和工業(yè)用材樹種，在改善生態(tài)環(huán)境及保障木材產(chǎn)量方面發(fā)揮重要作用。而我國干旱或半干旱地區(qū)占據(jù)國土面積50%以上，嚴重影響楊樹的生態(tài)和經(jīng)濟效益[14]。因此，培育楊樹抗旱新品種對于環(huán)境資源的改善與利用具有重要意義。近年來隨著林木基因工程技術(shù)的推廣和完善，楊樹抗旱相關(guān)基因功能研究及分子育種工作取得重大進展，例如與非轉(zhuǎn)基因楊樹相比，轉(zhuǎn)果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶SacB基因銀腺楊、轉(zhuǎn)脫水應答元件DREB1C基因南林895 楊（Populuseuramericanacv.‘Nanlin 895’）和轉(zhuǎn)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子ZxZF基因歐美楊（P.×euramericanacl.‘Bofeng1’）在抗旱性能方面均有所提高[15-17]。而目前關(guān)于組氨酸激酶基因在楊樹中的研究報道較少，其中在毛果楊（P.trichocarpaTorr. & Gray）基因組中有2 個AtHK3的同源基因PtHK3a和PtHK3b，并且這兩個基因均在形成層中表達量較高[18]。魯俊倩等[19-20]通過干旱、鹽、高溫、低溫脅迫以及激素處理發(fā)現(xiàn)，銀腺楊（P. alba×P. glandulosa‘84k’）HK3基因（PagHK3a、PagHK3b）在赤霉素、脫落酸、細胞分裂素和水楊酸處理后表達下調(diào)，在干旱、鹽、高溫和低溫脅迫條件下表達上調(diào)，說明PagHK3a和PagHK3b基因可能在楊樹抗逆境脅迫過程中發(fā)揮作用。

本研究以2 個銀腺楊組氨酸激酶PagHK3a基因敲除株系C1、C2 及其野生型（WT）為試驗材料，通過測定干旱脅迫下各株系的生理、生化與生長等指標，對基因敲除株系的抗旱性進行評價，同時探究PagHK3a基因在楊樹響應干旱脅迫過程中的相關(guān)功能，為培育抗旱基因編輯林木新種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為銀腺楊組氨酸激酶基因PagHK3a基因敲除株系C1 和C2 及其野生型（WT）。C1 和C2 株系的2 個Cas9 靶點（ sgRNA1，sgRNA2）均位于PagHK3a上的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（Histidine kinase domain），其中C1 株系編輯類型為靶點1 單堿基缺失，靶點2 雙堿基缺失純合體；C2 株系編輯類型為靶點1 單堿基缺失，靶點2 單堿基缺失純合體（圖1A）。C1、C2 株系均發(fā)生移碼突變，翻譯提前終止（圖1B）。

圖1 銀腺楊及其PagHK3a 基因敲除株系C1 和C2 靶點編輯情況Fig. 1 Schematic illustration of the sgRNA target site in wild type (WT) of P. alba × P. glandulosa and two mutant lines (C1 and C2)

1.2 干旱脅迫處理方法

1.2.1 PEG 模擬干旱脅迫處理 對WT 及基因敲除株系C1 和C2 進行組培擴繁，待生長25 d 后，選取生長一致的組培苗用于脅迫處理，每株系3 個生物學重復；將組培苗從固體培養(yǎng)基中小心取出，清水沖洗根系附著瓊脂后，移至霍格蘭營養(yǎng)液（Hoagland’s Nutrient Solution）中進行液體環(huán)境適應，每天更換一次營養(yǎng)液；5 d 后移至含有5%PEG 的霍格蘭營養(yǎng)液中進行模擬干旱脅迫處理，脅迫3 h 后，取成熟葉片，液氮速凍后用于RNA 提取、cDNA 反轉(zhuǎn)錄及相關(guān)基因表達量的測定。

1.2.2 溫室干旱脅迫處理 將培養(yǎng)4 周的組培苗移栽至上口徑12 cm，下口徑8 cm，高14 cm 的塑料花盆中，每株系30 株，栽培基質(zhì)為草炭土與珍珠巖（比例為5：1），移栽前稱量質(zhì)量并保持一致。生長地點位于中國林業(yè)科學研究院林木遺傳育種全國重點實驗室溫室，平均溫度約為25～30 ℃，平均相對濕度為50%～60%，通風條件較好，苗木生長期間進行正常水肥及病蟲害管理。

溫室培養(yǎng)45 d 后，選取生長狀態(tài)一致的盆栽苗進行干旱脅迫處理，每株系處理9 株。試驗共分為3 種水分處理方式：正常澆水、中度干旱和重度干旱，分別對應于田間持水量的70%～75%、40%～45%和25%～30%，每種處理3 個生物學重復。試驗采用稱重控水法，于每天早晨8：00 稱取各盆質(zhì)量，根據(jù)計算結(jié)果補充相應水分至試驗設計范圍內(nèi)。脅迫4 周后，進行生化、光合參數(shù)和生長指標的測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 基因相對表達量的測定 通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Primer Blast 功能設計實時定量 PCR 引物（ 表 1）， 以Actin（Pop_A01G010149.T1）基因為內(nèi)參基因，測定PagHK3a（Pop_G01G074644.T1）、PagRR2（ Pop_G08G060457.T1）、PagRR15（ Pop_G15G048786.T1）、PagNAC3（Pop_A01G074938.T1）、SOD4（Pop_G05G073560.T1）和POD1（Pop_A16G089950.T1）的相對表達量。

表1 實時定量PCR 引物序列Table 1 The primer sequences used for quantitative real-time PCR

PEG 處理3 h 后，分別取WT 及基因敲除株系組培苗成熟葉片0.1 g，利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根，北京）提取葉片總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 提取質(zhì)量，NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific，美國）測定RNA 濃度及純度后，利用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒（Takara，日本）進行cDNA 合成。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 稀釋10 倍后作為實時定量PCR 的模板，按照TB Green TM Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）試劑盒（Takara，日本）說明配制反應體系：TB Green Premix TaqII（TliRNaseH Plus，2 × ）10 μL，Primer-F/R 各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 補足至20 μL。利用LightCycler480 System（Roche，瑞士）進行實時定量PCR 反應，反應條件如下：預變性95 ℃ 30 s，擴增階段95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，45 個循環(huán)；熔解階段95 ℃ 5 s，60 ℃1 min，95 ℃；降溫階段50 ℃ 30 s。每個株系3 次技術(shù)性重復，最后通過2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量[21]。

1.3.2 生化指標測定 采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司相關(guān)試劑盒測定功能葉片丙二醛（MDA）含量、過氧化氫（H2O2）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物酶（POD）活性。測定方法為微量法，測定儀器為SpectraMax 190（Molecular Devices，美國），具體操作流程參考各試劑盒說明書。

1.3.3 光合參數(shù)測定 于脅迫處理最后一天上午9：00—11：30，選取自莖尖向下第4～6 片完全展開的功能葉片進行光合參數(shù)測定。光合參數(shù)測定采用LI-6400XT（Li-COR，美國）便攜式光合作用測量系統(tǒng)，測定指標為凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）以及蒸騰速率（Tr）；儀器光合有效輻射設定為1 000 μmol·m-2s-1，CO2濃度設定為400 μmol·mol-1。

1.3.4 生長指標的測定 在脅迫處理前后，分別利用鋼尺及游標卡尺測定植株株高與地徑，株高或地徑生長量為脅迫前后株高或地徑的差值；脅迫處理第28 d 時，將植株根系從盆中取出，清理表面基質(zhì)，自來水沖洗干凈，吸水紙吸干后置于干凈信封中，烘箱72 ℃烘干48 h 后測定根系干質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)整理與表格制作，通過SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)的單因素方差分析（one-way ANOVA）與多重比較（Duncan新復極差法），利用Graphpad Prism 9.0.0 進行統(tǒng)計圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫室干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除株系及野生型生長量差異

水分虧缺條件下，植物生長指標的變化能夠直接反映其抗旱能力的強弱。本試驗中，分別測定了基因敲除株系C1、C2 及WT 株系脅迫前后的株高與地徑，結(jié)果顯示：正常澆水條件下，PagHK3a基因敲除株系C1 和C2 株高生長量均低于WT，其中C2 株系與WT 相比差異顯著；隨著干旱脅迫程度的加深，C1、C2 及WT 株系的株高生長量均呈現(xiàn)出下降趨勢，其中WT 株系下降幅度較大，與正常澆水相比，中度干旱（D1）條件下WT 株系株高生長量減少10.6 cm，而基因敲除株系C1 減少3.9 cm，C2 株系減少1.1 cm。在重度干旱（D2）條件下，WT 株系株高生長量減少16.6 cm，而C1 株系減少15.4 cm，C2 株系減少9.5 cm。并且在中度干旱條件下，基因敲除株系平均株高生長量顯著大于WT，與WT 相比，C1 株系株高生長量高出5.3 cm，C2 株系高出4.0 cm；而在重度干旱處理中，基因敲除株系C1、C2 與WT 相比差異不顯著。另外，正常澆水及干旱條件下，基因敲除株系的地徑生長量與WT 株系差異均不顯著（圖2）。

圖2 干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除銀腺楊株系C1、C2 與WT 之間株高和地徑生長量的差異Fig. 2 Differences in plant height and ground diameter growth between PagHK3a gene knockout lines C1, C2 and wild-type of P. alba × P. glandulosa under drought stress

對根干質(zhì)量測定結(jié)果進行差異顯著性分析（表2）發(fā)現(xiàn)，與正常澆水相比，干旱脅迫處理后，WT 及基因敲除株系的根系均變得更加發(fā)達，根干質(zhì)量相應增加，尤其是在重度干旱條件下，基因敲除株系C1 與C2 以及WT 的根干質(zhì)量均顯著增加。然而，無論是在正常澆水還是在干旱脅迫下，兩個基因敲除株系的根干質(zhì)量與WT 相比差異均不顯著。

表2 干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除銀腺楊株系C1、C2 與WT 之間根干質(zhì)量差異Table 2 Differences in root dry weight between PagHK3a gene knockout lines C1, C2 and wild-type of P. alba ×P. glandulosa under drought stress

2.2 溫室干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除株系及野生型生化指標的差異

脅迫處理后，植物體內(nèi)氧化還原平衡出現(xiàn)紊亂，活性氧ROS 過度積累，進而使得植物防御系統(tǒng)受損，最終造成一定傷害[22-23]。本試驗中，對正常澆水及干旱脅迫條件下基因敲除株系C1、C2 與WT 株系葉片MDA、H2O2含量以及SOD、POD 酶活性進行測定分析，結(jié)果如圖3 所示：與正常澆水相比，干旱脅迫下，各株系MDA 含量均表現(xiàn)為增加的趨勢。另外在正常澆水條件下，C2 株系的MDA 含量顯著低于WT；在中度干旱條件下，C1、C2 株系MDA 含量均顯著低于WT，即中度干旱脅迫下，WT 細胞膜受損程度更加嚴重；而在重度干旱條件下，僅C2 株系MDA 含量極顯著低于WT，C1 株系與WT 相比差異不顯著（圖3A）。同時結(jié)果顯示，與正常澆水相比，WT 株系與2 種基因敲除株系的H2O2含量在干旱脅迫后也有所增加，但對比發(fā)現(xiàn)，脅迫處理后，WT 株系變化幅度更大，其中在正常澆水條件下，C1、C2 株系H2O2含量與WT 株系差異不顯著；在中度干旱條件下，C1、C2 株系H2O2含量均顯著低于WT，而在重度干旱組中，僅C2 株系顯著低于WT（圖3B）。即在中度干旱脅迫下，基因敲除株系受H2O2影響顯著小于WT。SOD 酶活性測定結(jié)果（圖3C）顯示，在正常澆水條件下，C2 株系顯著高于WT；在中度干旱條件下，C1 株系顯著高于WT；而在重度干旱脅迫下，C1、C2 株系SOD 酶活性與WT 相比均差異不顯著。POD 活性（圖3D）測定結(jié)果顯示，與正常澆水相比，干旱脅迫后，植株P(guān)OD 活性呈不斷上升的變化趨勢，在重度干旱處理組中各株系POD 酶活性最高。另外，在正常澆水及中度干旱條件下，C1、C2 株系POD 酶活性均值高于WT，但在重度干旱條件下，僅C2 株系顯著高于WT。

圖3 干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除銀腺楊株系C1、C2 與WT 生化指標差異Fig. 3 Differences in biochemical indexes between PagHK3a gene knockout lines C1, C2 and wild-type of P.alba × P. glandulosa under drought stress

2.3 溫室干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除株系及野生型光合參數(shù)差異

光合作用是植物生長發(fā)育所依賴的基本代謝過程。由于土壤含水量的降低，植株光合相關(guān)指標發(fā)生變化，從而影響植株生長[24]。脅迫處理末期，測定各株系光合參數(shù)（圖4）發(fā)現(xiàn)：與正常澆水條件相比，干旱脅迫下各株系光合參數(shù)下降，并且隨著干旱脅迫程度的加深，參數(shù)降低幅度逐漸增大。另外，在正常澆水條件下，與WT 株系相比，基因敲除株系的4 種光合參數(shù)均無顯著差異；而在干旱脅迫條件下，基因敲除株系與WT 相比有所差異。其中在中度干旱脅迫下，C1 株系凈光合速率顯著大于WT 株系，C2 株系與WT 相比差異不顯著；在重度干旱條件下，C2 株系凈光合速率顯著大于WT 株系，C1 株系與WT 之間差異不顯著（圖4A）。氣孔導度測定結(jié)果顯示，在中度干旱條件下，與WT 相比，C1 株系顯著高出15%，C2 株系顯著高出9%，即基因敲除株系均顯著大于WT；而重度干旱條件下，基因敲除株系C1、C2 與WT 差異不顯著（圖4B）。比較分析胞間CO2濃度（圖4C）發(fā)現(xiàn)，中度干旱條件下，C1、C2 株系顯著大于WT，而重度干旱條件下，僅C2 株系顯著大于WT。為減少水分過度損失，隨著土壤含水量的降低，各株系蒸騰速率（圖4D）均降低，但在干旱脅迫下，基因敲除株系的蒸騰速率與WT 株系相比差異不顯著。

圖4 干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除銀腺楊株系C1、C2 與WT 之間光合參數(shù)差異Fig. 4 Differences in photosynthetic parameters between PagHK3a gene knockout lines C1, C2 and wild-type of P. alba × P. glandulosa under drought stress

2.4 PEG 模擬干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除株系及野生型基因表達分析

為比較干旱脅迫下PagHK3a基因敲除株系C1 和C2 及野生型株系WT 間葉片中PagHK3a基因及其下游基因、脅迫相關(guān)基因、抗氧化相關(guān)基因表達差異，我們利用5%PEG 處理各株系組培苗。實時定量PCR 結(jié)果（圖5）顯示：與WT 相比，基因敲除株系中PagHK3a及其下游響應調(diào)節(jié)因子PagRR2和PagRR15基因表達顯著下降，而脅迫相關(guān)基因PagNAC3和POD1基因表達顯著上升。其中，在非脅迫處理條件下，基因敲除株系PagHK3a基因表達水平均顯著低于WT，其中C1 株系與WT 相比降低35.2%，C2 株系與WT相比降低22.4%；在PEG 脅迫處理條件下，與WT 相比，C1 株系PagHK3a表達水平降低26.5%，C2 株系降低26.9%。同時，各株系下游響應調(diào)節(jié)因子PagRR2和PagRR15基因表達與PagHK3a基因相似，非脅迫處理及脅迫處理條件下，基因敲除株系基因表達水平均顯著低于WT。脅迫響應相關(guān)基因PagNAC3的定量結(jié)果顯示，在非脅迫處理條件下，C1 株系PagNAC3基因表達水平為WT 的7.7 倍，C2 株系PagNAC3基因表達量為WT 的4.1 倍；在PEG 脅迫處理條件下，C1 株系PagNAC3基因表達水平為WT 的19.3倍，C2 株系為WT 的6.1 倍（圖5D）。超氧化物歧化酶合成基因SOD4表達結(jié)果顯示，在非脅迫條件下，僅C1 株系SOD4基因表達量顯著高于WT，在PEG 脅迫條件下，C1、C2 株系與WT 相比均差異不顯著。而對過氧化物酶合成基因POD1表達分析發(fā)現(xiàn)，與WT 相比，基因敲除株系C1、C2 在PEG 脅迫與非脅迫處理條件下均具有更高的表達水平，且差異顯著。

圖5 PEG 模擬干旱脅迫下PagHK3a 基因敲除銀腺楊株系C1、C2 及WT 葉片中相關(guān)基因表達水平Fig. 5 Expression levels of genes in leaves of PagHK3a gene knockout lines C1, C2 and wild-type of P. alba × P.glandulosa in Hoagland’s nutrient solution with 5% PEG

3 討論

干旱脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育及生物量的積累[25]。研究表明，株高、地徑等生長指標可以用于直觀地反映脅迫條件下植株的生長狀況[26]。本試驗中，基因敲除株系C1 和C2 在株高生長層面表現(xiàn)出相對優(yōu)勢，其中，與WT 相比，C1 和C2 株系的株高生長量在中度干旱條件下均顯著增加。同時水是植物進行光合作用的原料之一，在水分虧缺條件下，植株光合作用減弱[27]。本試驗結(jié)果顯示，干旱處理后各株系4 種光合參數(shù)均下降，并且重度干旱條件下各指標達到最低值。其中在中度干旱條件下，C1 和C2 株系的氣孔導度及胞間CO2濃度均顯著大于WT，表明基因敲除株系具有更強的氣體交換能力，進而保障植株CO2同化率[28]。另外，干旱脅迫能夠?qū)е轮仓牦w內(nèi)ROS 的產(chǎn)生及消除之間的動態(tài)平衡紊亂，而ROS 的過多積累使得植物發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，導致植物細胞膜受損[22]。并且研究發(fā)現(xiàn)，MDA 是細胞膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化反應過程中的重要產(chǎn)物，可用于反映植物細胞膜受損程度[29]。本研究結(jié)果顯示，在中度干旱條件下，C1 和C2 株系的H2O2及MDA 含量顯著低于WT 株系，即說明基因敲除株系受H2O2影響較小，細胞膜損傷程度更低。同時研究表明，細胞分裂素信號傳導與植物響應干旱脅迫存在密切聯(lián)系[9]。細胞分裂素信號傳導依賴于TCS 系統(tǒng)中的多級磷酸基團轉(zhuǎn)移機制，例如在擬南芥中，組氨酸激酶AtHK3 作為細胞分裂素受體，感知并接收細胞分裂素信號，通過下游HPts 以及RRs 之間的磷酸基團轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)信號的傳遞[30]。另外，RRs 分為A、B 兩種類型，B 型RRs 接收來自HPts 的磷酸基團，同時也可作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控A 型RRs 的轉(zhuǎn)錄[31]。本研究發(fā)現(xiàn)基因敲除株系中PagHK3a基因表達顯著下調(diào)的同時，PagRR2（B 型RRs）與PagRR15（A 型RRs）基因表達也顯著下調(diào)，因此推測PagHK3a下調(diào)表達引起了通路下游PagRR2表達量下降，進而影響了PagRR15的表達。與該結(jié)果相似，擬南芥ahk2ahk3cre1三突變體AtRR15的表達下調(diào)，同時突變體擬南芥表現(xiàn)得更加抗旱[11]；而擬南芥ahk3功能獲得型突變體ore12-1中，AtRR15則表達上調(diào)[32]。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，在干旱脅迫條件下，ahk2ahk3突變體、ahp2,3,5突變體中脅迫相關(guān)基因AtNAC3上調(diào)表達，并且AtNAC3基因過表達株系抗旱性增強[12,31,33]。與該結(jié)果類似，本試驗的兩個PagHK3a基因敲除株系PagNAC3基因的表達水平顯著上調(diào)。因此推測，干旱脅迫下，PagHK3a基因敲除株系通過細胞分裂素信號傳導途徑RRs基因下調(diào)表達，及抗逆相關(guān)基因如NAC3、抗氧化基因POD1等的上調(diào)表達，降低了植株細胞膜氧化損傷，增強了植株氣體交換能力，使植株具有更強的抗旱能力。

測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究的兩個PagHK3a基因敲除株系C1 和C2，其靶點1 編輯情況相同，均為純合單堿基缺失，蛋白翻譯均在2 個靶點間提前終止，即靶點2 的編輯類型差異不會影響其蛋白翻譯結(jié)果，理論上這兩個株系各項指標測定結(jié)果類似。然而，干旱脅迫結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1、C2 株系間存在一定差異。例如：PEG 模擬干旱脅迫下C1 株系PagNAC3基因表達水平明顯高于C2 株系；溫室重度干旱條件下，C2 株系MDA 含量、H2O2含量、POD 酶活性、凈光合速率以及胞間CO2濃度與WT 相比均差異顯著，而C1 株系差異不顯著。分析其中原因可能在于：一，在基因編輯操作中，發(fā)生在與目標編輯區(qū)域序列相似的位點上的非特異性編輯被稱作“脫靶編輯”[34]，盡管研究認為脫靶編輯在植物中發(fā)生頻率較低[35-36]，但由于脫靶效應造成的非預期編輯結(jié)果對基于基因編輯技術(shù)進行植物基因功能研究或分子育種研究可能產(chǎn)生的影響仍不可忽視。研究顯示，由于脫靶效應，編輯擬南芥AtETC2基因的同時，AtCPC、AtTRY基因也被編輯，導致植株葉片較小且表面呈現(xiàn)簇狀的毛狀體等脫靶性狀[37]。二，在植物組織培養(yǎng)過程中，由于繼代次數(shù)、培養(yǎng)條件等原因易造成植物體細胞突變事件的發(fā)生[34,38]，從而可能造成株系間存在差異。我們推測本試驗中兩個基因編輯株系的差異很可能是由脫靶效應或體細胞突變產(chǎn)生的，其產(chǎn)生的確切原因仍需進一步深入研究。

4 結(jié)論

銀腺楊PagHK3a基因敲除株系中細胞分裂素信號傳導通路中響應調(diào)節(jié)蛋白編碼基因PagRR2和PagRR15顯著下調(diào)表達，誘導脅迫響應基因PagNAC3和抗氧化基因POD1顯著上調(diào)表達；同時在中度干旱條件下，基因敲除株系C1 和C2 表現(xiàn)為膜系統(tǒng)氧化損傷更輕，H2O2含量更低，氣體交換能力更強，株高生長量更大，進而比WT 具有更強的抗旱能力。因此通過編輯楊樹組氨酸激酶基因能夠在一定程度上增強楊樹抗旱性。