胡楊PeERF1 基因提高轉基因銀腺楊84K耐旱性研究

葛曉蘭，杜久軍，張 磊,3，曲冠證，胡建軍,3＊

(1. 中國林業科學研究院林業研究所，林木遺傳育種全國重點實驗室，國家林業和草原局林木培育重點實驗室 北京 100091；2. 東北林業大學林學院，林木遺傳育種全國重點實驗室 黑龍江 哈爾濱 150006；3. 南京林業大學，南方現代林業協同創新中心 江蘇 南京 210037)

干旱是植物生長、發育和生產力的主要環境制約因素。由于林木壽命長，難以大規模灌溉，干旱極大地降低了許多森林生態系統的樹木生產力和存活率[1]。因此，加快對林木抗旱機制的剖析，提高林木對干旱的適應能力，是干旱土地利用、環境可持續性和提高經濟效益的迫切需要。為了適應干旱脅迫，植物已經進化出復雜的機制來感知外部信號，并通過調節基因的表達來協調代謝途徑和形態特征[2]。

AP2/ERF 家族轉錄因子調控植物的多種發育過程，在激素調控和逆境應答中發揮重要作用[3]。AP2/ERF 家族轉錄因子在高等植物中調控多種環境脅迫響應過程，如非生物脅迫（冷、熱、旱、鹽、滲透脅迫）和生物脅迫（食草昆蟲和微生物病原體）[4-8]。此外，許多研究表明，過表達AP2/ERF 家族轉錄因子的轉基因植物對非生物和生物脅迫的耐受性有所提高[9-11]。例如，對ERF76轉基因楊樹(Populus simonii×Populus nigra)轉錄組測序中發現有16 個上調轉錄因子基因和45 個脅迫相關基因的表達，提高了ABA（脫落酸）和GA（赤霉素）的生物合成能力，從而增強了楊樹對鹽脅迫的耐受性[12]。新疆楊(Populus albavar.pyramidalisBunge)PalERF109的過表達增強了楊樹的耐鹽性，進一步的分析表明，PalERF109直接上調了一個高親和力K+轉運體（HKT）基因PalHKT1;2。 表明PalERF109通過直接激活PalHKT1;2增強了耐鹽性，并擴展了對ERF基因在樹木脅迫反應中的作用的理解[13]。在鹽和干旱脅迫下轉基因ERF38過表達楊樹過氧化物酶（Peroxidase, POD）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量顯著增加，表明ERF38基因的過表達可以提高轉基因楊樹的耐鹽和滲透性[14]。

胡楊（Populus euphraticaOliv.）是分布于我國西北沙漠地區沙漠河岸森林的優勢樹種，在維持當地沙漠生態系統方面發揮著重要的作用[15]。由于其對極端惡劣環境的良好適應性，胡楊被認為是木本植物非生物脅迫耐受機制研究的典型模式物種[16]。前期通過對胡楊種子耐鹽全基因組關聯分析（Genome wide association study, GWAS）和轉錄組分析中獲得胡楊PeERF1基因[17]，通過亞細胞定位實驗發現PeERF1 為核定位蛋白，轉錄自激活實驗證明PeERF1基因具有轉錄自激活活性。耐鹽能力分析試驗證明胡楊PeERF1基因能夠增加轉基因植株的耐鹽性[18]，但其耐旱機制中的作用尚缺乏研究。本研究為探明胡楊PeERF1基因應答干旱脅迫的表達特點，以胡楊為材料研究PeERF1基因在模擬干旱脅迫（PEG）下不同組織的時空表達模式。通過對野生型銀腺楊（Populus alba×P. glandulosa ‘84k’, ‘84K’楊）、轉PeERF1基因過表達和抑制表達銀腺楊進行模擬干旱脅迫，觀察PeERF1基因在模擬干旱脅迫下表達模式、表型和生理指標的變化，為進一步探究該基因在植物抗逆中的功能提供依據。

1 研究方法

1.1 試驗材料

本試驗以胡楊野生型、84K 楊（WT）、35S::PeERF1過表達（PE）和35S::PeERF1-SRDX抑制表達（SE）轉基因銀腺楊為材料，35S::PeERF1是通過35S 強啟動子與PeERF1的cDNA 融合構建的載體轉化84K 楊獲得的轉基因植株，該轉化載體可以使目標基因過表達。35S::PeERF1-SRDX是由編碼SRDX 肽的核酸序列與PeERF1的cDNA 融合構建的載體轉化84K楊獲得的轉基因植株，該轉化載體可以特異性抑制目標基因的表達，轉基因植株由前期研究獲得[18]。轉基因組培苗保存于中國林業科學研究院林木遺傳育種全國重點實驗室，在含有約70 mL 生根培養基的培養瓶中生長，培養條件為光照強度6 000～8 000 lx、光照/黑暗周期16 h/8 h、平均溫度25 ℃、相對濕度60%～70%。

1.2 試驗方法

1.2.1 模擬干旱脅迫處理 本試驗在中國林業科學研究院科研溫室中進行，84K 楊組培苗在組培室生長1 個月后，選擇生長狀態一致且健壯的組培苗移栽（花盆規格：盆高 × 盆口直徑=22 cm × 20 cm），基質為草炭土∶珍珠巖=3∶1。在土培1 個月后選取生長狀態一致且健壯的植株進行模擬干旱處理試驗。

胡楊組培苗干旱處理，將在組培室生長1 個月且生長狀態一致的胡楊幼苗轉移到20%的PEG6000 溶液中，在處理的0、12 和24 h 時取根、莖和葉投入液氮后保存-80 ℃冰箱備用，每個處理3 次重復，每個重復3 株，每個處理共9 棵植株。

轉PeERF1基因84K 楊干旱處理，選擇轉基因PeERF1基因過表達（PE1、PE2）和抑制表達（SE1、SE2）高表達的各兩個株系，以及野生型（WT）試驗材料進行模擬干旱脅迫試驗，平均分為6 組，每組每個株系3 株，3 組用于20% PEG6000處理7 d，另外3 組為水處理作對照。處理后取葉片投入液氮后保存于-80 ℃冰箱備用，每個處理包含9 棵植株。

1.2.2 生物量測定 處理結束時隨機選取各處理各株系6 株，測量植株莖基部到莖尖部分為自然株高，株高數據以cm 為單位，保留一位小數。取植株地上部分，并用清水、蒸餾水、超純水依次清洗一遍，擦干水分后，用萬分之一天平測定植株鮮質量。

1.2.3 葉綠素含量測定 對84K 楊和轉PeERF1基因植株進行干旱脅迫處理7 d，取頂端第2 片新鮮葉片用于葉綠素含量的測定。用乙醇法對轉基因植株進行葉綠素含量測定[19]。

1.2.4 過氧化氫（CAT）、丙二醛（MDA）和過氧化物酶（POD）含量測定 取84K 楊和轉PeERF1基因植株干旱處理7 d 后由上而下第3、4 和5 片葉子測定過氧化氫（Catalase, CAT）、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）和過氧化物酶（Peroxide dismutase, POD）含量。具體操作步驟如下：液氮研磨后，取0.1 g 樣品，加入1 mL提取液，進行冰浴勻漿：8 000 g，4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測。采用索萊寶公司過氧化氫CAT 活性試劑盒[20]、丙二醛MDA 活性試劑盒[21]、過氧化物酶POD 活性試劑盒[22]分別進行CAT 含量、 MDA 含量和POD 含量測定。

1.3 數據處理與統計分析

根據采用2-△△CT法獲得qPCR 的差異表達倍數[23]。利用Excel 2018 軟件將所測得的數據進行成組數據T檢驗統計分析。本研究中各項指標測定時，測定值重復3 次后，用Excel 表格和Prism8軟件進行分析，組間比較用t值，當＊p＜0.05 時，差異顯著；＊＊p＜0.01 時，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下胡楊PeERF1 表達模式分析

為了研究PeERF1在不同組織中的表達模式，我們采用qRT-PCR 方法分別檢測了其在葉、莖和根中的表達水平。結果表明，PeERF1在胡楊葉、莖和根等不同組織中均有表達（圖1A），葉中的表達水平最高，其次是莖和根，其中葉中的表達量是莖的1.2 倍，是根的1.24 倍。

圖1 PeERF1 的時空表達模式分析Fig. 1 Analysis of spatiotemporal expression pattern of PeERF1

為了研究PeERF1在胡楊不同組織干旱脅迫下的時空表達模式，利用qRT-PCR 技術檢測了20% PEG6000 處理0、12 和24 h 后PeERF1在葉、莖和根中的表達水平，如圖1B～D 所示，PeERF1基因在胡楊葉片中表達量在干旱脅迫在反應初期（12 h）呈上調趨勢，在處理24 h 出現下調趨勢。而在莖和根中則表現出先下降后上升的趨勢。綜上可知，當胡楊受到干旱脅迫后12 、24 h 時，PeERF1基因均有不同表達，表明PeERF1基因參與植物干旱脅迫的調節過程。

2.2 干旱脅迫下轉PeERF1 基因84K 楊表達模式分析

為了研究干旱脅迫下84K 楊和轉基因PeERF1植株在不同組織中的表達模式，利用qRT-PCR 技術檢測了20% PEG6000 處理7 d 后84K 楊和轉基因PeERF1植株在葉（圖2A）、莖（圖2B）和根（圖2C）中的表達水平。結果顯示，在正常狀態和干旱脅迫條件下，轉基因株系在根、莖和葉中表達量均高于WT，且在葉片和莖中表現差異極顯著（圖2）。表明PeERF1基因在一定程度上能夠提高楊樹的耐旱性。

圖2 干旱脅迫處理轉PeERF1 基因不同組織部位表達模式分析Fig. 2 Analysis on the expression patterns of different tissue sites of PeERF1 transgenic lines under drought stress

2.3 干旱脅迫對轉PeERF1 基因84K 楊生長的影響

逆境脅迫嚴重影響著植物的生長發育，在葉片表型方面表現尤為顯著。與對照組相比，在正常生長狀態下，WT 和轉基因株系的生長形態沒有表現出明顯的變化（圖3A）。干旱脅迫后，過表達PE 轉基因楊樹生長狀態稍好，表現出較強的耐旱性，相反WT 和抑制表達轉基因植株SE 出現枯萎表現出不耐受，SE 轉基因株系葉片完全枯萎甚至死亡。

圖3 干旱脅迫對轉PeERF1 基因84K 楊生長狀態的影響Fig. 3 The effect of drought stress on the growth state of transgenic Populus alba × Populus glandulosa with PeERF1 gene

干旱脅迫處理一周后分別對處理組和對照組植株的株高（圖3B）和鮮質量（圖3C）進行測量后發現，與對照處理相比，脅迫后對照（WT）、過表達（PE1、PE2）和抑制表達（SE1、SE2）植株的株高和鮮質量均下降，各株系株高顯著下降，分別為對照組的86.0%、95.6%、94.3%、77.1%和70.8%，植株鮮質量也有相同趨勢，下降呈極顯著。由此可知，干旱脅迫會對植株生長量的增加、生物量的積累產生不利影響。與對照WT 植株相比，轉基因植株（SE）各株系在干旱脅迫下受到的不利影響更大，未處理前轉基因植株株高和鮮質量變化不明顯，將PeERF1基因抑制后會導致植株的和鮮質量均顯著下降，其中株高下降8.3%和14.7%，鮮質量下降20.3%和24.1%，差異均達到極顯著水平。以上實驗結果表明PeERF1基因在耐旱性中起著至關重要的作用。

2.4 干旱脅迫對轉PeERF1 基因84K 楊葉綠素含量和過氧化氫（CAT）含量的影響

為了研究干旱脅迫對轉PeERF1基因植株葉片葉綠素含量的影響，對過表達和抑制表達轉基因株系進行葉綠素含量測定（圖4A）。結果顯示，在正常狀態下，WT 和轉基因株系葉綠素含量差異不顯著；在干旱脅迫處理后，過表達轉基因株系葉綠素含量高于WT 葉綠素含量，差異極顯著；抑制表達轉基因株系葉綠素含量低于WT，且差異極顯著。

圖4 干旱脅迫對轉PeERF1 基因84K 楊葉片葉綠素含量和過氧化氫酶（CAT）含量的影響Fig. 4 Effect of drought stress on chlorophyll content and the content of catalase (CAT) in leaves of transgenic lines

為了研究干旱脅迫對轉PeERF1基因84K 楊葉片CAT 含量的影響，對過表達和抑制表達轉基因株系進行過氧化氫（CAT）含量測定（圖4B）。結果顯示，在正常狀態下，野生型和轉基因株系差異不顯著；在干旱脅迫處理后，過表達轉基因株系高于野生型，差異極顯著；抑制表達轉基因株系低于野生型，且差異極顯著。

2.5 干旱脅迫對轉PeERF1 基因84K 楊丙二醛（MDA）含量和過氧化物酶（POD）含量的影響

為了研究干旱脅迫對轉PeERF1基因葉片丙二醛（MDA）含量的影響，對過表達和抑制表達轉基因株系進行MDA 含量測定（圖5A）。結果顯示，在正常狀態下，WT 和轉基因株系MDA 含量差異不顯著；在干旱脅迫處理后，過表達轉基因株系MDA 含量低于WT；抑制表達轉基因株系MDA 含量高于WT，且差異極顯著。

圖5 干旱脅迫對轉PeERF1 基因葉片丙二醛（MDA）含量和過氧化物酶（POD）含量的影響Fig. 5 Effects of drought stress on malondialdehyde (MDA) content and peroxidase (POD) content in transgenic PeERF1 gene lines

為了研究干旱脅迫對轉PeERF1基因葉片POD 含量的影響，對過表達和抑制表達轉基因株系進行過氧化物酶（POD）含量測定（圖5B）。結果顯示，在正常狀態下，WT 和轉基因株系POD 含量差異不顯著；在干旱脅迫處理后，過表達轉基因株系POD 含量高于WT，差異極顯著；抑制表達轉基因株系POD 含量低于WT，且差異極顯著。

3 討論

植物的生理和生化變化在某種程度上反映了植物應對逆境的能力[24]。非生物脅迫總是在脅迫暴露的特定階段導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平增加，但ROS 對植物細胞具有細胞毒性[25]。因此，提高對ROS 的清除能力可能有利于植物對非生物脅迫的耐受。干旱脅迫常常導致植物體內ROS 的過度積累并導致氧化損傷[26]。嚴重的干旱脅迫會損害細胞離子、轉運蛋白和膜相關酶的功能，從而導致ROS 的產生[27]。在本研究中，由于干旱脅迫，所有株系葉綠素含量都顯著下降。可能是由于干旱誘導的葉綠素降解酶—葉綠素酶活性的增加[28]。但是過表達轉基因株系表現出比WT 更高的葉綠素含量，表明在干旱脅迫下葉片中的葉綠素含量受到保護，這可能是由于其具有較高的抗氧化酶活性，從而阻止葉片中葉綠素的降解。本研究中對POD 和CAT 含量測定結果也證實了這一情況。氧自由基引起膜脂質過氧化，降低膜的流動性和選擇性。以丙二醛含量（MDA）衡量的脂質過氧化被認為是應激引起的氧化損傷的指標[29]。前期對PeERF1基因進行耐鹽實驗表型和生理指標分析結果發現PeERF1基因可以提高鹽脅迫下84K 楊清除活性氧的能力和脯氨酸的積累，增強其耐鹽能力[18]。本研究對轉PeERF1基因楊樹進行干旱脅迫能力分析，發現正常條件下轉基因和非轉基因MDA 含量變化不明顯，干旱脅迫后PE 丙二醛含量低于WT，SE 則高于WT，這一結果表明，PeERF1基因具有誘導植物抵御干旱脅迫引起的氧化損傷的能力。

轉錄因子是一種調節蛋白，可以與下游基因啟動子中的特定順式元件結合，改變其表達水平。ERF 可以與一些順式元件結合，例如致病相關基因啟動子中的GCC 框和脫水基因啟動子中的DRE 基序[30]。擬南芥的AtERF1可以在不同的脅迫下與不同類型的順式元件結合[31]。因此，ERF 基因的過表達對改善生物脅迫和非生物脅迫都具有優勢。在本研究中，PeERF1基因已經被證明能夠與GCC-BOX、DRE、TGG1 和TGG2 元件特異性結合[18]。PeERF1可能與參與鹽分和干旱脅迫反應的下游基因的不同順式元件結合，因此修飾單個PeERF1基因可以提高植物耐旱性和耐鹽性。

本試驗的結果表明胡楊PeERF1基因作為抗旱相關的轉錄因子，參與了楊樹對干旱脅迫的調控，相關研究為后續胡楊抗旱機制的研究奠定了基礎，抗旱新基因的挖掘可為植物基因工程育種提供具有重大育種價值的基因資源。

4 結論

本研究結果顯示PeERF1基因在胡楊葉片中表達量最高，干旱脅迫下，轉PeERF1基因植株生長狀態及相關生理指標均發生顯著變化。PE 比WT 表現出更好的生長狀態，PE 的葉綠素含量、CAT 和POD 含量高于WT，MDA 含量低于WT；而SE 則表現出相反的性狀。表明PeERF1基因可以提高楊樹的抗旱能力。