血漿生物標志物MMP-8在預測活動性肺結核病診斷效能的評價*

張雅曦,張潔云,張明霞,楊倩婷,陳 騎

深圳市第三人民醫院肝病研究所,廣東深圳 518112

結核病(TB)是全球單一傳染源的大流行病,每年有近1 040萬新發TB病例和180萬例TB患者死亡[1]。據估計,全球三分之一的人口潛伏感染結核分枝桿菌(MTB),其中約10%的人可能會發展成活動性結核[1]。盡管近年來有一些新藥研發,但仍需要新的短程高效治療手段和深入了解TB潛在的發病機制。早發現早治療是傳染病的基本防控策略,也是降低發病率和病死率的重要措施。

活動性肺結核(ATB)患者肺腔里存在肺組織的損傷,其特點是MTB載量高,大量巨噬細胞吞噬MTB導致肉芽腫形成和氣蝕破壞基質[2],從而使其失去穩態保護作用和損傷后的組織重塑和修復能力,并釋放細胞外基質降解產物和侵蝕肉芽腫干酪化壞死,肺組織空化和破壞持續擴散,導致MTB進一步傳播[3]。基質金屬蛋白酶(MMP)是結核組織破壞的關鍵效應物[4]。抑制MMP活性來阻止基質被破壞并使結核相關的發病率和病死率降低,以及改善TB的治療效果[5-6]。MMP活性增加與多種感染以及非感染性肺部疾病中的炎癥反應有關[7]。

在前期工作中,本團隊利用蛋白芯片和流式技術比較不同類型的臨床樣本,篩選出多個血漿中生物標志物,其中發現在ATB患者MMP-8的表達水平顯著高于健康對照者(HC)和結核感染潛伏者(LTBI)。為了建立更為快速、便捷、應用廣泛的檢測方法,在此基礎上,本文采用化學發光法檢測結核菌多肽刺激后血漿中標志物MMP-8的表達水平,為ATB的輔助診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇于2022年5-9月在本院肺病醫學部住院的ATB患者143例,其中痰涂片陽性肺結核(AFB+TB)患者48例,平均年齡(43±18)歲;痰涂片陰肺性結核(AFB-TB組)患者95例,平均年齡(42±16)歲;LTBI患者44例,平均年齡(44±11)歲。另選取同期體檢的HC 120例,平均年齡(42±12)歲。各組間年齡比較差異無統計學意義(P<0.05),具有可比性。診斷依據《肺結核診斷和治療指南》中相關標準,入組標準:年齡在18～68歲,無自身免疫性疾病、未合并基礎疾病。ATB判定標準:(1)細菌學包括涂片抗酸桿菌檢查陽性和結核分枝桿菌分離培養陽性患者;(2)分子生物學僅分枝桿菌核酸檢測陽性;(3)影像學有胸部影像有ATB相符的病變;(4)病理學在肺組織病理符合TB病理改變。其中,AFB+TB患者微生物細菌學痰、肺泡灌洗液涂片陽性或培養陽性,AFB-TB患者細菌學陰性。LTBI入組標準:有結核接觸史,特異性結核分枝桿菌刺激γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)檢測陽性,影像學胸部X線片正常,臨床表現無癥狀且痰涂片中無結核分枝桿菌。(3)HC入組標準:均經胸部X線或CT 檢查,排除肺內外結核菌感染。既往無TB史,未服用抗結核藥物。本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2研究方法

1.2.1試劑與儀器:TB-DNA檢測試劑(達安基因股份有限公司),PCR擴增儀ABI-7500;痰培養試劑、全自動快速結核分枝桿菌培養儀BD-960;IGRAs檢測試劑盒(北京同生時代生物科技有限公司);斑點Elispot讀板儀(美國CTL公司);化學發光試劑盒、MMP-8試劑、化學發光儀器i2000(新產業生物醫學工程股份有限公司)。

1.2.2標本采集:用肝素鋰抗凝管采集各受試者10 mL全血,避免溶血。IGRAs檢測:取5 mL全血分離外周血單個核細胞(PBMC),PRMI1640培養基洗滌并計數細胞總數,終濃度為2×106/mL,每個樣本設陽性對照、空白對照和抗原檢測孔。全程嚴格按說明書執行。MMP-8檢測:取2 mL全血加入結核分枝桿菌特異性多肽PB、P8、P10(結核分枝桿菌多肽實驗室制備)5 μg/mL,混勻放置37 ℃培養箱孵育16～18 h,離心收集上清用于化學發光檢測。

1.3統計學處理 采用GraphPad Prism V7.0統計學軟件進行數據分析,計數資料采用百分率表示,采用χ2檢驗,通過受試者工作特征(ROC)曲線確定最佳閾值,計算曲線下面積(AUC)及95%置信區間(95%CI),以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1基于MMP-8化學發光檢測建立用于ATB診斷的預測 通過ROC曲線分析標志物表達水平對TB、LTBI和HC組的鑒別能力。閾值為10.84 ng/mL(超過閾值)時,MMP-8檢測結果能較好鑒別AFB+TB和HC,AUC為0.95(95%CI:0.92～0.98),準確度為0.85,靈敏度為0.94,特異度為0.83。在區分AFB-TB和HC對照組中AUC為0.89(95%CI:0.85～0.94),準確度為0.76,靈敏度為0.94,特異度為0.76。此外,鑒別AFB+TB和LTBI的AUC為0.96(95%CI:0.94～0.98),靈敏度為0.83,特異度為0.98。區分AFB-TB和LTBI的AUC為0.93(95%CI:0.90～0.97),靈敏度為0.76,特異度為0.98。見圖1。

圖1 ROC曲線分析MMP-8表達水平在各組間鑒別ATB中的預測

2.2不同檢測方法診斷AFB-TB、AFB+TB的效能評估 基于血漿多肽刺激的生物標志物在診斷應用的比較,本文評估了TB-DNA、痰培養、IGRAs和MMP-8檢測等方法對AFB-TB、AFB+TB患者的診斷效能。AFB+TB的檢出率分別為79.17%、52.08%、83.33%和85.42%。在AFB-TB的檢出率為21.05%、15.79%、61.05%和75.78%。同時,平行比較AFB-TB中MMP-8標志物檢測與其他3種方法在診斷效能方面,其各組間比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 不同檢測方法在AFB-TB、AFB+TB的診斷效能[n(%)]

3 討 論

TB是全球主要的公共衛生問題,特別是在發展中國家。TB高發的國家,耐多藥TB、糖尿病合并TB和人類缺陷病毒(HIV)合并TB等患者逐年增多,其臨床癥狀并不典型,即便聯合多種方法檢測臨床診斷依然困難,是結核感染者死亡的諸多原因之一[1]。

大多數TB診斷依賴于細菌學結核分枝桿菌涂片和培養,也是診斷TB的金標準[2-3];其中分子生物學Gene Xpert、TB-DNA檢測快速具有較高的靈敏度和特異度[7-8],但檢測受樣本限制;IGRAs檢測結核分枝桿菌特異性抗原刺激產生γ-干擾素,只能鑒別是否為MTB感染[9-10]。流式CD161檢測技術在菌陰、HIV合并感染、部分TB患者無痰或兒童可提高輔助診斷[11-12]。另一種基于尿液的生物標志物脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)被世界衛生組織推薦床旁快速有效,在HIV合并TB患者CD4<200個/微升,尿液檢出LAM有較好的特異性[13-14]。臨床微創支氣管纖維鏡檢查的開展,更直觀了解MTB引起的肺部病灶,其中病理組織學檢測和肺泡灌洗液的結核分枝桿菌培養可提高無痰患者、AFB-TB患者的檢出率[15]。然而,即使采用上述多種檢測方法,ATB的檢出率也不足50%,其主要原因為受樣本限制、高端檢測平臺無普及優勢、價格高昂、輔助性診斷局限等。這提示對診斷和預測標志物的深入研究是合理的,檢測血清或血漿中的生物標志物作為痰標本的替代方法,被認為是高危人群TB診斷的有效輔助方法[16]。因此,研發針對ATB的快速,有效的非痰診斷和預測方法以提高涂陰及不典型ATB診斷是目前面臨的重要挑戰。

MMP是一個蛋白水解酶家族,屬于鋅依賴性蛋白酶,結合鏈內切酶,具有多種生理作用,在酶催化中發揮著至關重要的作用[17];MMP的分泌主要受NF-κB、P38和MAPK信號通路的調節,參與組織細胞外基質和基底膜各種蛋白分解以及隨之而來的MTB釋放到氣道[18]。破壞細胞侵襲的組織學屏障,避免導致組織破壞、疾病傳播和死亡的酶[19-20]。MMP和組織基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是ATB免疫病理學的潛在調節劑[21]。也是肺結核(PTB)和肺外結核(EPTB)的非基于痰標本的生物標志物的候選者[22-24]。另外,本研究基于蛋白芯片檢測的結果篩選,通過化學發光法檢測血漿MMP-8水平建立判斷方法,其檢測結果更為穩定直觀、高效、便捷、特異、準確、實用,可為提高TB診斷提供有利支持。

化學發光法檢測血漿中MMP-8水平,能有效分辨出ATB患者及HC,其辨別AFB+TB和HC效能的靈敏度、特異度為0.94和0.83,AFB-TB和HC的靈敏度、特異度為0.94和0.76,在區分AFB+TB和LTBI效能的靈敏度、特異度為0.83和0.98,AFB-TB和LTBI的靈敏度、特異度為0.76和0.98。該檢測技術在涂陰結核的陽性率為75.78%,顯著高于其他檢測方法。本研究結果顯示,在AFB+TB和AFB-TB患者,MMP8檢測均能很好區分肺結核和健康人群。但目前臨床患者疾病類型復雜,包括細菌性肺炎疾病、非結核分枝桿菌感染和肺炎合并LTBI等炎癥反應與ATB患者非常相似,臨床常常難以區分LTBI或ATB(特別是AFB-TB者)。MMP-8檢測在AFB+TB和LTBI感染者鑒別中有較高診斷效率;但在AFB-TB和LTBI感染者中鑒別區分能力的特異性相對略低,可能存在肺組織部分感染或非感染性疾病引起的炎癥反應產生的非特異性影響。菌陰結核者在各結核檢測方法中比較,MMP-8檢測陽性率乃高于其他方法,在對提高AFB-TB的診斷有輔助效能。

綜上所述,本研究結果表明以結核分枝桿菌多肽刺激血漿MMP-8為標志物檢測可作為提高無痰或AFB-TB陽性率的輔助診斷技術,并在區分活動性結核和LTBI者具有較好的輔助效能。未來臨床抗結核治療用藥指導和EPTB的預測有待進一步研究。本研究為小樣本量數據結果,還需擴大樣本量進行多中心檢測進行下一步研究。