四川某大型綜合醫院艱難梭菌感染危險因素及分子特征*

朱曉艷,熊 麗,郭麗霞,杜寶忠,張勇倉△

1.西藏大學醫學院實驗中心,西藏拉薩 850000;2.四川大學華西醫院實驗醫學科,四川成都 610041;3.西藏大學醫學院基礎醫學部,西藏拉薩 850000

艱難梭菌感染(CDI)已成為醫療保健相關腹瀉的常見病因,占成人抗菌藥物相關性腹瀉的13%～28%[1]。臨床表現包括無癥狀攜帶、輕度腹瀉、暴發性感染性結腸炎,偶可危及生命。引起CDI的病原體艱難梭菌是一種嚴格厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌,該菌的主要毒力因子是腸毒素A(TcdA)和細胞毒素B(TcdB),以及部分高毒力菌株攜帶的二元毒素(CDT)。

病原微生物的分子流行病學研究是確定和控制疾病暴發或流行的關鍵,多位點序列分型(MLST)可用于全球流行病學微生物分型和細菌種群研究。通過檢索2013年1月之后公開發表在PubMed上的有關中國大陸艱難梭菌分子流行病學的相關文獻,發現我國目前對CDI的分子流行病學研究主要集中在北京、上海、浙江等地區,西南地區僅檢索到兩項相關研究報道[2-3]。為了更好地了解本地區CDI情況,本文通過調查研究四川某大型綜合醫院住院腹瀉患者的感染情況,了解本院CDI情況,同時采用MLST分型技術對分離的艱難梭菌進行分子流行病學研究,為我國西南地區CDI流行病學提供基礎數據,也為CDI防治和院內感染控制提供參考。

1 資料與方法

1.1標本來源 收集2020年5月至2021年8月四川某大型綜合醫院住院腹瀉患者(腹瀉次數≥3次/天)的糞便標本810份,采用酶免疫分析(EIA)法檢測谷氨酸脫氫酶(GDH)及艱難梭菌毒素A/B(CDAB)。收集CDI組及部分非CDI患者(non-CDI組)臨床資料,包括年齡、性別、住院時間、合并癥、抗菌藥物使用情況,以及部分實驗室檢測結果。收集GDH陽性患者的糞便標本,-20 ℃儲存待培養。

1.2儀器與試劑 GDH及CDAB抗原檢測試劑盒購自美國Alere公司,環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(CCFA)培養平板購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司,布氏瓊脂、脫纖維羊血、氯血紅素、維生素K1、Etest條購自青島海博生物公司,厭氧產氣包采用法國BioMérieux公司,細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技公司,PCR Taq酶、引物合成及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,質譜儀購自Bruker公司,PCR擴增儀購自美國ABI公司,凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3菌株分離培養及鑒定 將GDH陽性糞便標本接種于CCFA平板,37 ℃厭氧培養48 h,挑取淡黃色、扁平、邊緣不整齊的“油煎蛋”樣菌落進行基質輔助激光解吸-電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)鑒定,用哥倫比亞血平板分離、傳代培養鑒定為艱難梭菌的菌落,-80 ℃保存樣本。

1.4毒素基因檢測 依據細菌DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA,樣本保存于-20 ℃冰箱備用。參照LEMEE[4]及GRIFFITHS[5]的聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測艱難梭菌毒素基因tcdA、tcdB,序列如表1所示。

表1 艱難梭菌基因擴增引物信息

PCR反應體系25 μL:2×Taq PCR預混液12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL,DNA模板1.5 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;72 ℃ 7 min。擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像,觀察結果并記錄。

1.5統計學處理 采用SPSS23.0統計學軟件進行數據分析,本研究中患者年齡、住院時間、白細胞計數等計量資料為非正態分布,采用秩和檢驗;性別、抗菌藥物種類、是否合并低蛋白血癥等計數資料采用χ2檢驗。雙側檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統計學意義。

1.6多位點序列分型 參考GRIFFITHS[5]建立的MLST分型方法,擴增7個管家基因(adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi),引物序列見表1。PCR反應體系25 μL:2×Taq PCR預混液12.5 μL,管家基因上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL,DNA模板1.5 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應條件:95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s,35個循環;72 ℃ 7 min。擴增產物經電泳后成像,觀察結果,將與預期條帶大小一致的樣品送生物公司測序。測序結果上傳數據庫(https://pubmlst.org)獲得等位基因號及ST型。使用MEGA X構建所得艱難梭菌的親緣進化樹[6]。

1.7藥敏試驗 將萬古霉素、甲硝唑、莫西沙星的藥物Etest條貼在強化布氏瓊脂平板(含有1 μg /mL維生素K1,5 μg/mL氯血紅素和5%去纖維羊血)上,37 ℃厭氧培養48 h后讀取最低抑菌濃度(MIC)。結果判讀標準參照歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(EUCAST 2017歐盟藥敏試驗標準)及美國臨床實驗室標準協會(2021 CLSI-M100)折點。以艱難梭菌ATCC 700057為質控菌株。

2 結 果

2.1標本來源及艱難梭菌分離培養情況 810例糞便標本中檢出GDH陽性標本163例,163例標本分離培養出136株艱難梭菌,艱難梭菌檢出率為16.79%(136/810)。136例患者主要來自13個科室檢出率,排列前5位依次為:感染科23例(16.91%)、血液內科20例(14.71%)、消化內科19例(13.97%)、老干科17例(12.50%)、ICU 16例(11.76%)。各科室艱難梭菌檢出率見表2,ICU檢出率高達28.07%,腎臟內科次之,為26.19%。

2.2毒素基因檢測結果 136株艱難梭菌毒素基因檢測結果顯示,產毒菌株79株,其中(tcdA+tcdB+)65株,占47.79%(65/136),(tcdA-tcdB+)14株,占10.29%(14/136),非產毒菌株(tcdA-tcdB-)57株,占41.91%(57/136)。根據毒素基因檢測結果,CDI陽性率為9.75%(79/810)。各科室CDI陽性率見表2。腎臟內科最高,為19.05%,老干科次之,為15.07%。

2.3CDI患者一般情況及危險因素分析 結合79例CDI患者臨床資料,男48例(60.76%),平均年齡(56.85±21.34)歲;女31例(39.24%),平均年齡(57.72±20.35)歲。不同年齡段CDI發生率分別為:<18歲5.41%(2/37),18～35歲5.41%(8/148),>35～55歲3.72%(7/188),>55～65歲4.92%(6/122),>65歲7.94%(25/315)。不同年齡段CDI發生率差異無統計學意義(χ2=4.232,P=0.375)。79例CDI患者主要來自8個科室,排列前5位依次為:感染科、老年科、血液內科、消化內科、腎內科,見表2。

表2 各科室艱難梭菌檢出率及毒素基因型分布情況

CDI組79例與non-CDI組136例臨床資料及危險因素統計學比較,合并腎臟疾病的患者更易感染艱難梭菌(P<0.05),而合并心血管疾病或糖尿病患者并不是CDI的高危因素(P>0.05)。性別、年齡、抗菌藥物等藥物暴露在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。實驗室檢查結果顯示,CDI組糞便隱血率(87.34%)顯著高于對照組(56.62%),差異有統計學意義(P<0.05)。CRP、血清清蛋白、總膽汁酸等其他實驗室檢測結果在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 艱難梭菌感染組與非感染組統計學比較或n(%)]

2.4多位點序列分型 采用PCR方法擴增136株艱難梭菌的7個管家基因,共獲得29個ST型。排列前5的型別有ST39 30株(22.00%)、ST54 20株(15.00%)、ST3 19株(14.00%)、ST37 11株(8.00%)ST35 10株(7.00%),見圖1。分析該5個ST型在各科室的分布情況,發現ICU與感染科各有8株ST39,均占26.70%(8/30),余ST型在各科室分布無規律。

圖1 136株艱難梭菌MLST型分布圖

采用MEGA軟件構建136株艱難梭菌的進化關系圖,見圖2。Clade1為本研究難難梭菌主要分支。本研究發現1株ST11,該菌株來自消化內科,追溯消化內科該時段未發現ST11型別的流行趨勢。

注:黑色分枝代表Clade1;黃色圓圈代表Clade3;藍色分枝代表Clade4;紅色分枝代表Clade5;圈外數字代表菌株編號;圈內數字代表進化樹Boostrap檢驗值,>50為結果可信。

2.5藥敏試驗 43株艱難梭菌對3種抗菌藥物的MIC結果見表4。所有菌株對萬古霉素和甲硝唑均敏感,對莫西沙星耐藥率為26.83%。其中非產毒株有4株對莫西沙星耐藥,產毒株中有7株對莫西沙星耐藥,非產毒株對莫西沙星耐藥率33.3%,較產毒株22.6%高,但兩組差異無統計學意義(χ2=0.525,P=0.467)。

表4 43株艱難梭菌藥敏結果及MIC范圍(mg/L)

3 討 論

過去十年,CDI被認為是北美和歐洲成年人醫院相關性腹瀉的主要原因,因而逐漸受到重視。由于我國對CDI的研究起步較晚,加之艱難梭菌對培養條件要求較為嚴苛,目前對CDI的流行病學研究地域分散,未形成完整的全國感染情況報告。本研究對810例住院腹瀉患者進行評估,了解本院CDI的陽性率、高危因素、分子特征等情況,補充該地區對CDI的研究數據,為醫院內感染控制及臨床診治提供數據支撐。

美國疾控中心一項多中心研究顯示,CDI陽性率為7.00%～20.00%[7]。中國一項Meta分析顯示,腹瀉患者中產毒艱難梭菌發病率為14.00%[8]。本研究中CDI陽性率為9.75%,低于云南地區報道的14.30%[3],分析可能為控制抗菌藥物使用的效果。ICU患者具有大量使用抗菌藥物、高齡、住院時間長、并發癥較多等特點,因此CDI發生率較高。本研究ICU醫療單元艱難梭菌檢出率雖然較高,但產毒菌株分離僅5株(8.77%),低于既往研究的17.80%[9]。

既往研究報道的CDI危險因素包括:高齡、抗菌藥物和(或)質子泵抑制劑暴露、住院時間長、合并腎臟等慢性疾病。本研究發現,合并腎臟疾病患者更易感染艱難梭菌,考慮慢性腎臟疾病可能導致抗菌排泄不良,血液中藥物濃度過高,從而導致腸道菌群失調[10]。高齡及使用質子泵抑制劑不是本研究中CDI的危險因素。有研究指出CDI發生的部分原因可能是患者使用抗菌藥物導致腸道菌群結構變化,而不是高齡[11]。實驗室檢查、糞隱血在CDI患者占比明顯較高,考慮CDI導致腸黏膜變性、壞死引起。

隨著CDI抗菌治療和新治療方法如糞便微生物菌群移植(FMT)的研究日益增多,2021年歐洲臨床微生物學和傳染病學會(ESCMID)在《成人艱難梭菌治療指南》中指出將非達霉素和萬古霉素作為治療CDI的一線藥物,而不再將甲硝唑作為首選藥物[12]。由于非達霉素未在我國上市,因此本研究采用萬古霉素及甲硝唑進行藥敏試驗。有研究已發現甲硝唑耐藥菌株,一項研究指出耐藥菌株對甲硝唑和萬古霉素的耐藥率分別為1.80%和0.40%[13]。我國一項研究發現,艱難梭菌對甲硝唑具有異質耐藥性,且該類型的耐藥性只出現在第一代培養菌株中,幾代后就會消失[14]。由此可知,艱難梭菌對這兩種藥物的耐藥性在我國和其他國家不盡相同。本研究與國內多數研究一致,未發現萬古霉素及甲硝唑耐藥菌株。雖然莫西沙星不用于治療CDI,卻是臨床常用抗菌藥物。臨床上在使用該類抗菌藥物后出現腹瀉要警惕CDI[15]。本研究產毒株與非產毒株對莫西沙星耐藥率分別為22.58%、33.33%,低于德國[16]與中國上海地區[17]的相關研究報道。

本研究136株艱難梭菌的優勢型別為ST39、ST54、ST3和ST37,與其他相關報道[17-19]具有一定差異,說明艱難梭菌的優勢ST型具有地域差異性。ST37毒素基因型別為tcdA-tcdB+,對應的核糖體分型為RT017,該型別曾在全球多次報道,以及與之相關的非暴發病例,特別是在亞洲[20]。該基因型在亞洲許多國家被報道為優勢產毒菌株之一,在我國也普遍存在[20]。本研究分離出11株ST37型艱難梭菌,其在各科室呈散在分布。有報道指出,ST37 (RT017)引起的臨床癥狀與高毒力株ST1(RT027)相似[21],且這些菌株對多種抗菌藥物的耐藥性大于其他ST型,易導致復雜、嚴重的CDI[22],因此對其防控不容忽視。

綜上所述,艱難梭菌的分子型別具有地域差異性,合并腎臟疾病的患者更易感染艱難梭菌,雖然目前艱難梭菌對常用抗菌藥物均較敏感,但為預防CDI的發生,臨床醫生需針對患有慢性腎臟疾病等慢性基礎疾病的患者控制抗菌藥物的使用。由于我國對艱難梭菌的研究較為分散,本研究可為我國西南地區CDI流行病學提供基礎數據。