五種臨床常用結核分枝桿菌檢測方法的應用性評價*

智深深,陶俊吉,丁 燕,李 維△

1.重慶大學附屬中心醫院檢驗科,重慶 400030;2.重慶醫科大學檢驗醫學院,重慶 400042

結核病的全球病死率高于艾滋病和瘧疾,是傳染病中的首要死因,這在很大程度上是由于其診斷困難。據統計,40%的結核病病例未能被識別和報告。據世界衛生組織估算,全球每年新發結核病患者超過1 000萬例,死亡患者超過140萬例;中國新發患者數約占全球的8.4%,約83.3萬,居全球第三位,僅次于印度和印度尼西亞。中國估算結核病發病率為58/10萬(2018年61/10萬),在30個結核病高負擔國家中估算結核病發病率排第28位,高于俄羅斯(50/10萬)和巴西(46/10萬)[1]。在如此嚴峻的形勢下,急需一套靈敏而又特異的檢測方案來加強對于結核分枝桿菌感染者的篩查和診斷,以達到更高的醫療效率。目前臨床常用的結核分枝桿菌實驗室檢測方法有結核抗體膠體金法(TB-ab)、結核分枝桿菌-DNA熒光定量PCR法(TB-DNA)、抗酸染色涂片法(AFS)、液基夾層杯抗酸染色法(LBSC)、結核特異性γ-干擾素釋放試驗(IGRA)、結核菌素皮膚試驗(TST)等,但各個方法均有因其自身所導致的一定的局限性[2]。本研究分析了2019年1月至2022年6月于重慶大學附屬中心醫院(下稱本院)進行TB-DNA、TB-ab、AFS、IGRA、LBSC這5種檢測方法診斷的患者資料,以臨床最終診斷為金標準,對5種方法的結果進行對照和聯合分析,評估5種方法在結核分枝桿菌感染診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2022年6月在本院分別進行TB-DNA、TB-ab、IGRA、AFS、LBSC這5種檢測方法診斷的患者資料,結核病的臨床診斷參照中華人民共和國衛生行業標準(WS288-2017)[3],結核病分類參照中華人民共和國行業標準(WS196-2017)[4]。排除標準:(1)免疫功能缺陷或低下的患者;(2)臨床未給出準確診斷的患者;(3)無完整病歷資料的患者。根據標準,排除181例患者,最終共收集5 411例患者,其中男3 356例,女2 055例,年齡(62±18)歲,其中確診為結核病793例。確診患者中,非活動性肺結核141例;活動性肺結核652例,其中活動性肺結核497例,活動性肺外結核155例。

1.2材料與方法

1.2.1TB-DNA 取患者清晨第一口痰,立即保存送檢。采用圣湘生物結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)和杭州安譽PCR儀AGS4800進行檢測和分析,按照試劑盒說明書標準規程操作,根據Ct值是否≤39判斷結核分枝桿菌DNA是否為陽性。

1.2.2IGRA 采集患者清晨空腹靜脈血,使用萬泰結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒分別吸取1 mL分裝為樣本、陰性對照、陽性對照3管,37 ℃孵育24 h,放入優邁科Caris200全自動化學發光免疫分析儀進行檢測并判斷結果。

1.2.3LBSC 采用天騎醫學抗酸染色液-Ⅰ和天騎醫學夾層杯-Ⅰ,將檢測標本(痰液、胸腔積液、腹水、腦脊液)消化后離心,去上清液并烘干,對杯底的高分子膜及其附著在膜上的有效成分進行抗酸染色,按照說明書標準規程操作,通過顯微鏡觀察是否為抗酸桿菌陽性。

1.2.4TB-ab 采用艾博生物醫藥結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法),對患者血清進行檢測,根據試紙條檢測線和質控線是否出現紫紅色條帶判斷患者是否存在結核分枝桿菌IgG抗體。

1.2.5AFS 采用龐通醫療器械抗酸染色液(Ⅲ型),將痰液均勻涂片后,進行抗酸染色,通過顯微鏡觀察是否抗酸桿菌陽性。

1.3統計學處理 采用IBM SPSS Statistics 24和MedCalc20.022軟件包完成數據的統計描述以及分析,以臨床診斷為金標準,計算出各檢測方法及方法組合的陽性率、靈敏度、特異度,以約登指數評價檢測方法的優劣,以Kappa一致性系數評價檢測方法與臨床診斷的一致性,Kappa≥0.75,說明兩種方法診斷結果一致性較好,0.40≤Kappa<0.75,說明兩種方法診斷結果一致性中等,Kappa<0.40,說明兩種方法診斷結果一致性較差。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各檢測方法單獨使用及聯合使用對結核分枝桿菌感染的診斷的真實性指標 根據各個方法的檢測結果,以臨床診斷為金標準,計算相應的陽性率、靈敏度、特異度和Kappa值一致性系數。TB-DNA、TB-ab、IGRA、AFS、LBSC這5種方法用于結核分枝桿菌感染的診斷的靈敏度分別為71.21%、61.32%、78.16%、21.27%、37.94%;特異度分別為98.11%、63.64%、66.52%、99.59%、99.81%;Kappa值分別為0.453、0.111、0.360、0.247、0.392。單項檢測中,靈敏度最高的是IGRA(78.16%),特異度最高的是LBSC(99.81%);陽性預測值最佳的為LBSC(95.65%),陰性預測值最高的為IGRA(92.83%),約登指數最高的是TB-DNA(0.693),Kappa值最高的為TB-DNA(0.453),見表1。

表1 各方法單獨使用及聯合檢測對結核病診斷的真實性指標

依據各方法聯合使用時的檢測結果,采用平行試驗原則,即多種方法聯合使用時其中一種方法檢測為陽性則判斷為陽性,以臨床診斷為金標準,計算相應的陽性率、靈敏度、特異度、約登指數和Kappa值一致性系數。聯合檢測靈敏度最高的組合是IGRA+LBSC+TB-ab 3項(95.24%),特異度最高的組合是TB-DNA+LBSC(98.23%);約登指數最高的組合項為IGRA+TB-DNA(0.722),Kappa值一致性系數最高的組合項是IGRA+TB-DNA(0.558)。IGRA+DNA的約登指數和Kappa值高于單項和其他組合項,在此基礎上聯合更多的檢測方法對于提高診斷效能和診斷一致性并無明顯作用。LBSC+DNA組合的約登指數和Kappa值雖不如IGRA+TB-DNA,但仍相對較高,考慮檢測價格及開展條件,此組合仍值得推廣。

2.2各檢測方法及IGRA+TB-DNA對不同結核病類型檢測的陽性率對比 根據結核病的狀態和部位,將參照中華人民共和國衛生行業標準(WS288-2017,WS196-2017)確診為結核病的患者分為3組:活動性肺結核組、非活動性肺結核組、活動性肺外結核組。檢測方法單獨使用時,3組中都是IGRA的陽性率最高,分別為83.6%、74.2%、83.8%,而當IGRA聯合TB-DNA使用時,活動性肺結核組和活動性肺外結核組的陽性率相比IGRA單獨使用都有所提升,分為92.4%、84.6%,而非活動性肺結核組則有所下降,為66.7%。見表2。

表2 各檢測方法對不同結核類型的陽性率(%)

3 討 論

控制傳染源并及早地發現和治療結核病患者,尤其是開放性的肺結核患者是結核防治的重要手段,結核分枝桿菌的檢測是防治的基礎,因此,及時準確的檢測方法尤為重要。然而,目前臨床使用的檢測方法包括結核菌素皮膚試驗、涂片鏡檢、免疫學試驗,均存在不足之處。結核菌素皮試及TB-ab常出現假陽性,卡介苗接種人群可呈陽性;雖然AFS及LBSC快速簡單,但檢出率低,且其他分枝桿菌的感染抗酸染色也呈陽性;許多有癥狀的結核病患者因為無法取到高質量或帶菌的標本,從而導致AFS無法檢測到結核分枝桿菌[5];IGRA雖可排除標本采集的影響,但其假陽性較高;雖然培養方法被認為是結核病診斷和耐藥性檢測的“金標準”,但是需要4～12周才可獲得最終確認報告[6]。因各種實驗室檢測方法的局限性,導致結核感染的診斷存在一定困難,而這與結核病在全球范圍內死灰復燃具有相關性。因此需要從傳統的疾病診斷方法和管理方法轉變方式,引入新的檢測工具或策略,從而到達盡早盡快地管控的目的。

本研究通過對5 411例進行了TB-DNA、TB-ab、AFS、IGRA、LBSC的患者的檢測結果進行分析,探討5種檢測方法單獨使用及聯合使用對結核分枝桿菌感染的診斷價值。為了評價并對比各檢測方法及方法組合的診斷價值,本研究將幾種方法聯合檢測的結果進行邏輯回歸,得到多種方法聯合的預測概率值,以此綜合反映其診斷能力,通過對各檢測方法單獨及聯合使用的診斷價值進行比較分析發現,LBSC聯合TB-DNA使用的診斷一致性與IGRA聯合TB-DNA的診斷結果一致性相當,均高于IGRA單獨使用,但在此基礎上再增加其他方法聯合使用并沒有獲得更高的診斷價值。

本研究中AFS、LBSC和TB-DNA等以痰為標本的細菌學和分子生物學檢測方法在單獨使用和聯合使用時,都表現出了高特異度和低靈敏度的特點,而這與臨床標本取樣質量、患者結核病狀態和部位、標本的處理過程等眾多因素都有所相關。因此,這些方法單獨用于早期結核分枝桿菌感染的診斷的價值有限[7-8]。

TB-ab和IGRA這兩種以血清為標本的免疫學檢測方法在本次研究中也呈現出不同的特點。TB-ab的靈敏度和特異度都比較低,IGRA雖然特異度較低,但靈敏度高于其他4種檢測方法。TB-ab簡單易行,價格低廉,但非結核分枝桿菌感染和卡介苗(BCG)的接種也會導致假陽性,免疫缺陷患者中檢出率也較低,因此不建議單獨用于結核分枝桿菌感染的確診[9]。IGRA不受卡介苗的影響,受非結核分枝桿菌的影響也較小,較少出現假陰性,但其假陽性較多,因此推薦作為結核分枝桿菌感染的補充檢測[10],2017版的結核病診斷標準中也新增了此項作為診斷依據。

本研究顯示約登指數最高的組合為IGRA+TB-DNA,在此基礎上聯合更多的檢測方法對診斷價值的提高并無明顯作用。Kappa值最高的組合IGRA+DNA只有0.558,按照Kappa值對于診斷試驗的判斷標準,達到0.75以上才算診斷一致性較高[11]。出現這種情況,可能是由于本研究篩選的患者雖然去除了免疫低下或缺陷的患者,但仍然存在一部分免疫力有缺陷患者可能并沒有在病歷中描述清楚從而導致免疫學方法失效。同時,由于潛伏期結核感染缺乏金標準,因此存在潛伏期結核感染并沒有被臨床醫生診斷的情況。并且,確診患者中存在非活動性肺結核和肺外結核,這些患者的痰中存在病原體的概率較小,導致細菌學方法和分子生物學方法對其的診斷效能大大下降[12]。

在本研究中,AFS、LBSC和TB-DNA等以痰為標本的細菌學和分子生物學方法對非活動性肺結核和肺外結核的陽性率較低,最高只有10.8%,這與文獻[13-15]研究結果相似,陽性率在0.0%～20.0%。對于活動性肺結核IGRA的陽性率高達83.6%,其余4種方法的陽性率最高只有53.1%,有研究顯示IGRA檢測活動性肺結核非常高的陽性率,在85.0%～90.0%[16-17]。而將IGRA和TB-DNA聯用時,雖然非活動性肺結核的陽性率有所下降,但活動性肺結核和肺外結核的陽性率均有所提高,達到了92.4%、84.6%。因此,臨床醫生可以根據臨床情況合理選擇檢測方式以提高診斷效率。

在對結核分枝桿菌感染的診斷試驗的檢測結果進行分析時,需注意假陽性和假陰性的原因。例如,非結核分枝桿菌感染的患者進行AFS和LBSC檢測時因為也是抗酸染色陽性,容易被誤認是結核分枝桿菌,同時因為臨床癥狀和結核病也比較相似,也易被診斷為結核病[18]。免疫學方法TB-ab和IGRA則容易受到患者的免疫狀態影響,同時輸入帶有結核抗體的血液制品也會導致TB-ab出現假陽性[19]。

IGRA聯合TB-DNA的檢測時間短,靈敏度、特異度都相對較高,在一定程度上區分結核和非結核分枝桿菌感染,診斷優勢明顯優于其他方法聯合。對于不能進行結核分枝桿菌培養和非結核分枝桿菌鑒定的醫院來說,IGRA聯合TB-DNA在結核分枝桿菌感染的診斷價值值得臨床醫生重視;結核病的流行病學調查顯示其發病率與經濟發展呈負相關,除了檢測方法本身的優劣,經濟條件也是需要考慮的重要因素,LBSC聯合TB-DNA檢測的靈敏度雖然不如IGRA聯合TB-DNA,但特異度較高,陽性預測值也優于后者,加之該方法簡單易行成本較低,在基層醫療機構具有較好的應用前景。