自噬蛋白Beclin-1與N-myc下游調控基因2在食管鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義*

張 穎,王 宇

長治市人民醫院病理科,山西長治 046000

食管癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一,被列為全球第六大常見的癌癥死亡原因[1]。流行病學研究表明,食管癌具有明顯的地理、種族和性別差異,食管鱗狀細胞癌(ESCC)是東亞地區最常見的食管癌組織學類型,在我國約90%的食管癌為ESCC[2-3]。與食管腺癌相比,ESCC惡性程度高、生物侵襲性強,盡管近年來診斷與治療策略已取得了重大的進展,但患者總體生存(OS)率仍然很低[4-5]。為了提高ESCC的早期診斷和改善患者預后,迫切需要尋找有價值的分子標志物和新型治療靶點。

自噬是真核細胞降解、去除受損的細胞器或突變的細胞成分,維持細胞內環境穩定的重要途徑[6]。既往研究發現,異常的細胞自噬與癌癥、阿爾茨海默病等多種疾病有關[7-9]。隨著腫瘤的惡性增殖,癌細胞由于營養缺乏,可以通過自噬獲得能量并降解其內部成分以支持腫瘤的增殖和代謝。作為第一個自噬特異性基因,Beclin-1在細胞自噬的調節中發揮著重要作用[10-11]。目前,多項研究顯示Beclin-1在非小細胞肺癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤組織中存在表達缺失,并參與了腫瘤的發生發展[12-14]。然而,Beclin-1作為ESCC患者預后標志物的臨床價值尚有待進一步研究。N-myc下游調控基因2(NDRG2)是N-myc下調基因家族的成員之一,該家族的蛋白質以α/β水解酶折疊為主要特征[15]。越來越多的證據表明,NDRG2作為一種腫瘤抑制因子,在癌細胞的增殖、黏附、侵襲和轉移等方面發揮關鍵作用[16-17]。此外,NDRG2的表達抑制被報道與多種腫瘤的治療結果及不良預后密切相關[18-19]。有研究表明,上調NDRG2可抑制食管癌細胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質轉化(EMT)等的生物學行為[20]。然而,NDRG2在ESCC患者中的潛在預后價值仍不清楚。因此,本研究的主要目的是通過免疫組織化學染色檢測Beclin-1與NDRG2在ESCC組織樣本中的表達水平,并分析兩者與患者臨床病理特征及預后的關系,旨在探討兩種蛋白作為ESCC預后分子標志物的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選擇2015年6月至2018年10月在本院胸外科接受食管癌根治性切除手術的121例ESCC患者作為研究對象,前瞻性收集其手術切除標本(包括未受腫瘤侵犯的癌旁正常組織)及臨床病理資料,其中男63例(52.1%)、女58例(47.9%),平均年齡為(67.3±11.4)歲,平均腫瘤最大徑(5.41±1.93) cm,高、中、低分化癌分別占42.1%(51/121)、38.0%(46/121)和19.9%(24/121);根據第8版食管癌TNM分期,Ⅱ～Ⅲ期病例占所有患者的54.5%。所有入選本研究的患者均應符合以下條件:(1)ESCC的診斷經術后組織病理學證實;(2)無肺、骨、肝等遠處轉移;(3)臨床病理資料完整;(4)隨訪時間大于1個月。

本研究經本院倫理委員會批準,所有組織樣本與臨床病理資料均在患者知情同意的情況下采集。

1.2免疫組化染色與結果判讀 將手術切除的ESCC腫瘤組織經福爾馬林固定、石蠟包埋后,制成厚度為4 μm的連續切片,進行免疫組織化學染色與分析。組織切片用二甲苯脫蠟,在濃度遞增的乙醇中水化。使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,置于pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱孵育20 min,用以抗原修復。隨后,在切片上加入3%的H2O2溶液,阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后,將組織切片與1∶200比例稀釋的Beclin-1(產品編號:SC11427,Santa Cruz公司,美國)與NDRG2一抗混合,并在4 ℃下孵育過夜。次日,將組織切片與辣根過氧化物酶標記的IgG二抗繼續孵育30 min。使用二氨基聯苯胺顯色劑處理所有載玻片,并以蘇木精復染、梯度乙醇脫水,中性樹膠封片固定。

由兩位高年資病理科醫生對組織切片進行獨立評估,根據Beclin-1、NDRG2的染色強度和陽性染色細胞數量進行半定量分析。染色強度的評分標準如下:陰性為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕色為3分。陽性染色細胞數量的評分標準:在光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野,每個視野計數200個細胞,陽性染色細胞比例<5%為0分,比例5%～25%為1分,比例>25%～50%為2分,比例>50%～75%為3分,陽性染色細胞比例>75%為4分。Beclin-1、NDRG2蛋白免疫組化染色的最終得分由染色強度與陽性染色細胞比例的分數乘積計算得出。將≤4分者納入Beclin-1或NDRG2低表達組(陰性表達),>4分者分入Beclin-1或NDRG2高表達組(陽性表達)。如果兩位評價者的結果有沖突,則由第3位病理學家進行復核,并協商得出相對一致的結果。

1.3隨訪 本科負責對所有研究對象進行定期隨訪,通過查閱門診或住院病例及電話探訪等方式了解患者的生存狀態。生存分析的主要研究結局為OS,所有患者的OS從手術當天開始計算,直至因任何原因死亡或最后一次隨訪作為觀察終點。截至末次隨訪,全組無失訪病例,中位隨訪時間為35.0個月。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行數據收集、處理和統計分析,采用Pearson相關評估Beclin-1、NDRG2表達與臨床病理變量之間的相關性。高、低表達組ESCC患者的生存概率通過Kaplan-Meier曲線計算,Log-rank檢驗用于生存分析的比較。采用Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析,確定ESCC患者的獨立預后因子,在單因素分析中的顯著變量被納入多因素分析進一步評估。風險比(HR)和95%置信區間(CI)用于評估測試參數對死亡事件的影響。上述所有統計檢驗均為雙側分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Beclin-1、NDRG2在ESCC組織中的表達及其臨床意義 Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC組織中的免疫組化表達結果如圖1所示,Beclin-1、NDRG2的陽性表達主要定位于正常食管上皮細胞的細胞質中。在檢測的121例樣本中,Beclin-1蛋白在ESCC腫瘤組織中的陽性表達率為40.5%(49/121),明顯低于癌旁組織的59.5%(68/121),差異有統計學意義(χ2=5.973,P=0.015)。NDRG2蛋白在ESCC組織中的陽性表達率亦明顯低于癌旁組織,分別為46.3%(56/121)和61.2%(74/121),差異有統計學意義(χ2=5.385,P=0.020)。免疫組化染色的結果證實與癌旁組織相比,Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC組織中呈明顯低表達。

注:A和C為Beclin-1和NDRG2蛋白在癌旁組織中呈高表達;B和D為ESCC組織中呈低表達。

分析Beclin-1和NDRG2表達與ESCC臨床病理特征的關系,如表1、表2所示,Beclin-1低表達者有更為頻繁的淋巴結轉移(χ2=6.158,P=0.013)和更為進展的TNM分期(χ2=4.538,P=0.033),而NDRG2低表達與更晚的T分期(χ2=6.607,P=0.010)和TNM分期(χ2=5.744,P=0.017)相關。然而,未發現Beclin-1和NDRG2表達與患者年齡、性別、組織學分化或腫瘤最大徑之間存在顯著性關系(P>0.05)。

表1 Beclin-1表達與ESCC患者臨床病理特征的關系[n(%)]

表2 NDRG2表達與ESCC患者臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 ESCC患者預后因素的單、多變量Cox回歸分析

2.2Beclin-1、NDRG2表達在ESCC患者中的預后意義 在這個隊列中,所有ESCC患者的3年和5年OS率分別為51.0%和31.4%,Kaplan-Meier生存曲線顯示Beclin-1低表達與高表達患者的3年OS率分別為44.3%和60.9%,Beclin-1低表達與ESCC患者不良預后顯著相關(χ2= 5.696,P=0.017),如圖2A所示。此外,NDRG2低表達者的預后亦明顯劣于NDRG2高表達者,3年OS率分別為43.9%和59.2%,差異有統計學意義 (χ2=9.004,P=0.003),如圖2B所示。

圖2 Beclin-1、NDRG2表達與ESCC患者OS的關系

單因素Cox分析結果顯示,組織學分化(P=0.002)、TNM分期(P<0.001)、Beclin-1(P=0.020)及NDRG2低表達 (P=0.004)與ESCC患者的低OS率顯著相關。在多因素Cox回歸模型中對這些參數做進一步調整,結果證實Beclin-1低表達(HR=1.727,95%CI:1.017～2.934,P=0.043)、NDRG2低表達(HR=1.671,95%CI:1.023～2.730,P=0.040)及TNM Ⅱ～Ⅲ期(HR=3.823,95%CI:2.133～6.852,P<0.001)是ESCC患者預后不良的的獨立預測因素。

3 討 論

自噬在保護和殺傷腫瘤細胞方面扮演著雙重作用,已成為目前腫瘤學研究的一個重要方向[21-22]。Beclin-1是細胞自噬過程中的一個關鍵調節因子,其表達變化也被報道與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關。在本研究中,本文通過免疫組織化學發現Beclin-1在ESCC組織中的表達明顯低于癌旁組織,其低表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移顯著相關,是ESCC患者預后不良的獨立預測因素。Beclin-1異常表達及其在腫瘤癌變、進展中的作用已逐漸被認識,多數研究表明,Beclin-1通過細胞自噬維持基因組的穩定性,在癌變的早期階段顯示出抑制作用。據報道,研究人員在約58.3%的卵巢癌、60.0%的胃癌和70.0%的肺癌中觀察到了Beclin-1的表達缺失[13,23-24]。ALABIAD等[23]的研究表明,Beclin-1在漿液性卵巢癌組織中的低表達與低分化癌和晚期腫瘤顯著相關,是肝癌、乳腺癌等患者復發轉移及預后不良的預測標志。這些研究結果表明,Beclin-1在包括ESCC在內的惡性腫瘤中低表達,可能引起細胞自噬活性受到抑制,腫瘤細胞失去自噬能力而逐漸獲得逃避細胞凋亡和增殖、侵襲的能力,促進腫瘤的發生與轉移。GUO等[25]報道Beclin-1表達缺失明顯加快了食管癌細胞在體外的增殖速度,提高了細胞的抗凋亡與遷移能力。因此,以Beclin-1作為治療靶點抑制ESCC的發生和進展,或許可以為改善治療結果和延長患者生存提供方向。

NDRG2參與了細胞增殖、分化等多種病理生理過程,作為另一個新發現的腫瘤抑制因子同樣備受關注。有研究發現,NDRG2在多種人類癌癥中表達下調,與腫瘤的侵襲性特征與不良預后密切相關[26-28]。本研究的結果顯示,NDRG2在ESCC樣本中的表達明顯低于癌旁組織,其低表達與更晚的T分期、TNM分期有關,提示NDRG2表達缺失可能在ESCC的進展中發揮關鍵作用。本研究發現NDRG2低表達患者的OS率明顯低于高表達者,NDRG2是ESCC患者的獨立預后因子。YANG等[20]的研究證實了本文的推測,發現食管癌細胞中的NDRG2表達明顯低于正常食管上皮細胞,而上調NDRG2表達可顯著減少細胞在體外形成集落的數量,抑制細胞的侵襲、遷移能力并促進細胞凋亡。體內動物實驗也表明NDRG2對腫瘤生長具有顯著抑制作用。此外,有研究報道了NDRG2表達缺失對EMT的誘導作用,NDRG2可通過影響E-鈣黏蛋白、波形蛋白、基質金屬蛋白酶的表達,調節腫瘤細胞的侵襲、轉移能力[29-30]。這些數據進一步支持NDRG2表達缺失參與了ESCC的發生發展,揭示了其作為ESCC患者預后分子標志與治療靶點的潛在價值。

綜上所述,本研究發現Beclin-1和NDRG2在ESCC樣本中存在明顯低表達,兩者的表達水平與T分期、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關,可作為ESCC患者預后不良的預測分子。這些信息有助于進一步探索Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC發生發展中的生物學功能及作用機制,并為分子靶向治療提供潛在靶點。