血清miR-146b-3p、miR-133a-3p檢測在新生兒急性呼吸窘迫綜合征病情評估和預后預測中的臨床價值*

袁小又,張 妍,冷 惠

崇州市人民醫院兒科,四川成都 611230

新生兒急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由于肺泡毛細血管通透性過度導致的低氧血癥和雙側肺水腫的急性發作,在新生兒中極為常見,以呻吟發紺、吸氣三凹征、呼吸衰竭、呼吸困難為主要表現特征[1]。但新生兒ARDS呈現出發展快速、病情嚴重、死亡率較高等特點,對新生兒生命造成了嚴重威脅,即使生存的新生兒患者,其神經系統及肺功能也受到一定損傷,影響其生長發育[2]。新生兒ARDS病因較多,目前尚無完全定論,目前也缺乏針對新生兒ARDS的特異性治療方法,因此尋找新生兒ARDS發病和預后的生物學標志物意義重大。微小RNA(miRNA)是一類調節基因表達的非編碼RNA,通過與互補的靶mRNA結合,導致mRNA降解或翻譯,在維持免疫穩態中發揮重要作用,失調的miRNA表達可能參與許多疾病的發病機制,包括新生兒ARDS疾病[3]。miR-146b-3p作為miRNA家族成員,在膿毒癥誘導的ARDS小鼠模型中,miR-146b-3p水平下降,上調miR-146b-3p水平可改善膿毒癥小鼠ARDS癥狀,為ARDS的臨床治療奠定了理論基礎[4]。然而HUI等[5]研究發現miR-133a-3p在膿毒癥誘導的ARDS小鼠顯著增加,下調miR-133a-3p水平可能通過抑制炎癥反應和肺組織細胞凋亡對膿毒癥介導的ARDS發揮保護作用,但兩者在新生兒ARDS中少有報道,因此本研究旨在探討血清miR-146b-3p、miR-133a-3p檢測在新生兒ARDS病情評估和預后預測中的臨床價值,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取于本院2020年4月至2021年8月新生兒科的收治的108例新生兒ARDS患兒。納入標準:(1)診斷標準符合《新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒(2017年版)》[6];(2)急性起病(發病時間小于3 d),胎齡超過34周,入住重癥監護室時間超過72 h;(3)結合患者臨床癥狀、體征以及經影像學檢查確診,其中超聲心動圖結果顯示無左心房高壓,X線胸片顯示雙肺彌漫性陰影,透明度降低,毛玻璃顆粒狀;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)先天性代謝紊亂、先天性心臟病、原發性肺泡表面活性物質缺乏;(2)肺外嚴重感染;(3)肺和胸壁畸形或先天畸形。本研究已獲得本院醫學倫理委員會批準。

以確認為ARDS為研究起點,以死亡或痊愈出院為終點,將108例新生兒ARDS患者分為生存組、死亡組,其中生存組73例患兒治愈和病情好轉出院,死亡組35例病情危重放棄治療和死亡。另外,108例新生兒ARDS患者依據病情嚴重程度及入住24 h首次胸片結果分為輕度組及重度組。其中輕度組包括X射線結果Ⅰ級(雙肺透亮度降低,伴有細小顆粒與網狀陰影)和Ⅱ級(支氣管充氣征,病變至肺野中外帶),共70例;重度組包括X射線結果Ⅲ級(心緣模糊,透亮度降低,病變加深)和Ⅳ級(支氣管充氣征加重,肺野呈白肺),共38例。

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集 收集108例新生兒ARDS患者的臨床資料,包括年齡、性別、分娩方式、出生體質量以及母親基本資料等,并對所有患兒確診后12 h內應用新生兒急性生理學評分圍生期補充Ⅱ(SNAPPE-Ⅱ)進行評分,評分范圍0～162分,分值越高,病情越嚴重。

1.2.2樣本采集 患兒均于確診次日空腹采集5 mL靜脈血,于4 ℃下,3 000 r/min離心10 min,取上層血清于-80 ℃低溫保存樣本。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測血清中miR-146b-3p、miR-133a-3p水平 取出血清樣本,采用RNA提取試劑盒(貨號:74014,廣州創侖生物制品有限公司)提取總RNA,以紫外分光光度計(型號:UV-2204,上海析譜儀器有限公司)檢測RNA純度和濃度。根據反轉錄試劑盒說明(型號:K1622,北京智杰方遠科技有限公司)合成cDNA,然后在PCR擴增儀(型號:Veriti96,美國ABI公司)上進行擴增,反應體系為1 μL上下游引物,12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM,總體積為 25 μL(包含反應水),設置擴增條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s,45個循環。并使用2-ΔΔCt方法計算miR-146b-3p、miR-133a-3p水平。miR-146b-3p上游引物:5′-TGA GAA CTG AAT TCC ATA GGC T-3′,下游引物:5′-GCA CTG TCA GAC CGA GAC AAG-3′;miR-133a-3p上游引物:5′-GCC TTT GGT CCC CTT CAA C-3′,下游引物:5′-TAT GCT TGT TCT CGT CTC TGT GTC-3′;內參U6上游引物:5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′,下游引物:5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。

2 結 果

2.1比較兩組患者一般資料 與生存組相比,死亡組在患兒性別、胎齡、出生體質量、宮內窘迫、胎糞吸入綜合征、新生兒窒息、母親年齡及糖尿病方面差異均無統計學意義(P>0.05),SNAPPE-Ⅱ評分顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較或n/n)

2.2兩組血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平比較 與生存組相比,死亡組血清miR-146b-3p水平均顯著降低,miR-133a-3p水平顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 較兩組血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平

2.3不同嚴重程度新生兒ARDS患者血清中miR-146b-3p、miR-133a-3p水平比較 與輕度組相比,重度組血清miR-146b-3p水平均顯著降低,miR-133a-3p水平顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 比較不同嚴重程度新生兒ARDS患者血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平

2.4新生兒ARDS患者血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平的相關性 Pearson法分析顯示,新生兒ARDS患者死亡組血清miR-146b-3p與miR-133a-3p水平呈負相關(r=-0.441,P<0.05),見圖1。

圖1 分析血清中miR-146b-3p、miR-133a-3p水平的相關性

2.5血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平對新生兒ARDS患者死亡診斷價值分析 血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平診斷新生兒ARDS患者死亡的曲線下面積(AUC)分別為0.883、0.829,靈敏度分別為82.86%、68.57%,特異度分別為83.56%、87.67%;二者聯合診斷新生兒ARDS患者死亡的AUC、靈敏度、特異度分別為0.923、91.43%、78.08%。見圖2。

圖2 血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平診斷新生兒ARDS患者預后的ROC曲線圖

3 討 論

新生兒ARDS是一種嚴重威脅新生兒生命的呼吸危重癥,主要表現為不同程度的低氧血癥、肺順應性下降、彌漫性透光率下降、炎性滲出,是新生兒呼吸衰竭和死亡的重要原因[7]。目前ARDS患兒的治療主要以對癥綜合治療為主,如肺表面活性物質替代、呼吸及營養支持、體外膜肺氧合等,但新生兒ARDS治療難度大,死亡率仍然較高[8],因此尋找新的生物標志物以幫助預測新生兒ARDS的死亡風險,從而做出積極干預措施對改善其預后至關重要。

miRNA是由20～23個核苷酸雙鍵組成的非編碼RNA,可以與mRNA上的特定靶標相互作用以調節基因表達,從而起到抑制或降解靶標的作用,參與各種細胞過程,包括細胞活力、分化、凋亡、免疫反應和不同的病理過程,特別是miRNA在血液樣本中水平相對穩定,可作為診斷或預后的生物標志物[9]。miRNA參與ARDS的發生發展,調節炎癥反應和細胞凋亡,是ARDS潛在的新型生物標志物和治療靶點[10]。如新生兒ARDS血清miR-200c-3p水平顯著增加,與病情的嚴重程度有關,對于新生兒ARDS預后具有一定的診斷價值[11]。蔣萍萍等[12]研究證明,miR-150在ARDS患者血清中呈低表達,其有望成為ARDS發病和預后預測的生物學標志物。既往有研究表明,miR-146b-3p主要作為炎癥和癌癥的調節因子發揮作用,但其在許多肺部疾病也發揮關鍵作用[13]。先前研究報告顯示,沙杰等[14]發現與良性肺結節患者和健康者相比,miR-146b-3p在非小細胞肺癌患者外周血中顯著過表達。miR-146b-3p被證明可能是肺腺癌的血液潛在生物標志物[15]。除此之外,LIU等[4]研究證明上調miR-146b-3p表達可改善膿毒癥小鼠ARDS癥狀。基于以上文獻調研,推測miR-146b-3p可能也與新生兒ARDS疾病有關。本研究結果顯示與生存組相比,死亡組血清miR-146b-3p水平顯著降低。提示miR-146b-3p可能參與新生兒ARDS的病情進展。本研究還發現隨著病情的加重,血清miR-146b-3p水平顯著降低,表明miR-146b-3p水平與新生兒ARDS病情危重程度有關。

miR-133a-3p也是miRNA家族成員。SHAN等[16]研究發現肺腺癌患者中miR-133a-3p的表達較與健康對照者相比顯著升高,聯合其他miRNA可以提高肺腺癌的診斷能力,有望作為診斷肺腺癌的潛在生物標志物。LI等[17]研究發現,肺癌組織中miR-133a-3p的低表達與肺癌患者的不良預后相關,miR-133a-3p的過表達增加了非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性,可為人類非小細胞肺癌治療提供潛在治療策略。推測miR-133a-3p可能也與肺部疾病有關。另外,蘭超[18]等研究發現miR-133a-3p的mRNA表達量在膿毒癥患者中表達升高,且隨著病情加重呈現逐漸升高趨勢,可作為膿毒癥診斷的特異性標志。HUI等[5]研究發現在膿毒癥介導的 ARDS小鼠miR-133a-3p顯著增加,下調miR-133a-3p表達可減輕ARDS小鼠癥狀,但是對于新生兒ARDS鮮有報道。本研究發現與生存組相比,死亡組血清miR-133a-3p水平顯著增加,且隨著病情的加重,血清miR-133a-3p水平逐漸增加,表明miR-133a-3p水平與新生兒ARDS預后及危重程度有關。ZHANG等[19]研究發現ARDS患者血清中miRNA異常表達,可能與患者病情嚴重程度和預后密切相關。本研究相關性顯示死亡組血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平呈負相關,進一步說明了miR-146b-3p水平越低,miR-133a-3p水平越高,新生兒ARDS發生死亡的風險越大。ROC曲線顯示,血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平診斷新生兒ARDS患者死亡的AUC分別為0.883、0.829,靈敏度分別為82.86%、68.57%,特異度分別為83.56%、87.67%;二者聯合診斷新生兒ARDS患者死亡的AUC、靈敏度、特異度分別為0.923、91.43%、78.08%,表明二者聯合對新生兒ARDS預后具有較好的預測價值。

綜上所述,血清miR-146b-3p、miR-133a-3p水平與新生兒ARDS患者嚴重程度及預后密切相關,且二者聯合對新生兒ARDS患者與預后預測具有一定的價值,有望作為新生兒ARDS患者預后預測的潛在標志物。但文章樣本量較少且缺乏相關機制的研究,未來將針對其不足進行改善進而進一步驗證本結論。