杜仲葉發酵綜合利用的研究進展

胡競月， 岳 芽， 譚 欣， 徐 鶯， 莊國慶， 時小東

（1.成都大學食品與生物工程學院農業農村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106；2.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064；3.四川省林業科學研究院，四川 成都 610081）

杜仲（Eucommia ulmoides）是杜仲科的單科單屬植物，其適應性強，在我國分布廣泛，在湖北、湖南、四川、江西、安徽、河南等27 個省、自治區、直轄市均有栽培（Li 等，2020b；Wu 等，2018）。 杜仲渾身是寶， 其干燥樹皮和葉均被收載于《中國藥典》，具有降血壓、強筋骨、抑菌等作用（Yan 等，2022；Huang 等，2021；Lyu 等，2017）。 杜仲葉作為潛在的新食品和杜仲膠資源， 已經逐漸成為研究熱點（Yan 等，2023；Li 等，2022a；郭姝等，2020）。微生物發酵是提高植物活性成分、改變功效、降低毒性的常用方法（Li 等，2020a）。 本文對杜仲葉發酵后營養物質、活性成分以及揮發性成分的變化，杜仲葉發酵在食品、 飼料方面應用的研究以及杜仲葉及其內生菌發酵產物的功效研究進行綜述，以期為杜仲葉的開發和綜合利用提供參考。

1 杜仲葉發酵的物質變化

1.1 非揮發性成分的變化 杜仲葉含有粗蛋白質、脂肪和氨基酸等營養成分，以及綠原酸、黃酮類、環烯醚萜類、多酚等活性成分，發酵過程中微生物的代謝活動使杜仲葉的非揮發成分含量發生變化（Li 等，2022b；Wu 等，2021）。 經過產朊假絲酵母和黑曲霉菌復合發酵的復配杜仲葉， 其粗蛋白質、 總氨基酸、 必需氨基酸的含量從發酵前的12.41%、9.76%和3.74%增加到25.23%、17.49%、6.34%（曹銀娣等，2020）。 白腐真菌固態發酵能夠促進木質素水解酶作用而釋放出還原糖， 從而提高杜仲葉片中還原糖的產量（Qian 等，2020）。 燕飛等（2022）研究發現，杜仲葉制品發酵前期以脂肪代謝為主，后期則表現為戊糖、葡萄糖醛酸轉換代謝、抗壞血酸和醛酸代謝豐度增加。發酵過程中微生物通過對外界物質的利用進行生長和代謝活動，導致其生存、增殖和副產物的合成（De Villa等，2021）。 杜仲葉中營養成分的變化與發酵時間呈相關性， 在其他植物葉發酵中也有相似結果（Wang 等，2022）。 同時， 外界微生物能夠引起活性成分含量的變化以及新物質的形成（Adebo 等，2022；Qiao 等，2022）。 在杜仲葉發酵中，研究主要集中在綠原酸、黃酮、萜類等非揮發性活性成分的變化。劉夢培等（2018）研究發現，隨著發酵時間的增加，杜仲葉中總黃酮、總酚、綠原酸的含量呈先增加后下降的趨勢，發酵第4 天時相對較高。屠萬倩等（2020）研究發現，渥堆發酵提高了杜仲葉中京尼平苷酸、 桃葉珊瑚苷和車葉草苷等環烯醚萜苷的含量，而黃酮類成分的含量變化相對較小。內生菌與植物的協同進化關系決定了某些內生菌具有產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質的能力（魏寶陽等，2011）。 Shi 等（2012）從杜仲葉中篩選分離產松脂醇二葡萄糖苷（PDG）內生真菌，具有微生物發酵法工業化生產PDG 的潛力。

1.2 揮發性成分的變化 發酵可以引起揮發性物質發生變化進而導致風味的改變， 能夠有效解決不良氣味等問題（Li 等，2023；Kim 等，2021）。基于氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）聯用技術對食用菌株杜仲葉發酵產物中揮發性物質進行分析，共鑒定出68 種化合物，包括醇、醛、酮、酸、酯等（Wang 等，2020）。 利用植物乳桿菌、德式乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌對杜仲葉水提液進行發酵， 無論哪種乳酸菌發酵后揮發性成分的種類和含量均增加， 能夠降低杜仲葉青葉味而產生具有花香味的二氫-α-紫羅蘭酮（劉夢培等，2021）。 曾橋等（2022） 運用茯磚茶生產工藝對杜仲葉茶發酵， 也證實微生物發酵能夠降低杜仲葉本身不良氣味揮發性成分而提升呈香揮發性物質。 微生物發酵對杜仲葉揮發性成分的影響是個復雜的過程，與菌株和工藝等密切相關，其將作為杜仲葉產品改善和品質提升的重要手段。

2 杜仲葉發酵產物的功效研究

2.1 抗氧化及抑菌作用 杜仲葉中的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷等活性成分與其抗氧化活性相關（屠萬倩等，2022）。 發酵能夠對杜仲葉的抗氧化能力產生影響。 劉夢培等（2018）研究表明，杜仲葉發酵產品的DPPH 自由基清除能力、鐵還原力與發酵時間及其活性成分的變化趨勢一致。通過巴氏醋酸桿菌As141 發酵杜仲葉，DPPH、羥基自由基清除活性和還原力的IC50值分別達到2.62、27.21 μg/mL 和1.72 mg/mL，表明通過發酵杜仲葉，發酵產物的抗氧化活性得到提高（Jia 等，2019）。在動物試驗中也證實發酵后杜仲葉復合物能顯著提高總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和總抗氧化能力（TAOC）（曹銀娣等，2021）。 在抑菌方面，Jia 等（2020）研究了杜仲葉發酵醋對不同微生物的抑制效果，發現對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、酵母等均有一定的抑制作用，抑菌活性明顯優于對照組。

2.2 生長性能及免疫力作用 杜仲葉及其提取物具有改善動物生長性能和提高機體免疫力的作用（陳玉敏等，2015；Zhou 等，2009）。 添加0.3%發酵杜仲葉日糧能夠提高生長育肥豬的平均末重、平均日增重和屠宰率，且料重比顯著降低，說明發酵杜仲葉粉的添加提高了豬的生長性能（段明房等，2018）。 適量杜仲葉復合發酵產物能夠對肉仔雞十二指腸絨毛高度、 空腸絨毛高度及隱窩深度均產生影響，進而增強腸道消化吸收能力，促進肉雞的生長性能（曹銀娣等，2020）。將杜仲葉發酵和提取作為飼料添加劑飼喂幼齡雞， 發酵組雞的平均體重顯著高于提取物組與對照組， 同時增加了血清球蛋白含量， 表明杜仲葉發酵物較提取物不僅可以促進雞的生長發育， 而且能提高機體免疫力（李卓妮等，2022）。彭密軍等（2019）在斷奶仔豬飼糧中添加杜仲葉提取物、 發酵杜仲葉和杜仲葉干粉， 結果表明杜仲葉提取物在促進斷奶仔豬生長性能和提高免疫能力等方面優于發酵杜仲葉和杜仲葉干粉， 但未對其差異性形成原因進行深入研究。而在羅非魚中，添加杜仲葉提取物未對其生長性能產生顯著影響，但能夠通過激活Nrf2 信號通路提高腸道抗氧化能力和抑制TLR2-MyD88-NF-κB 信號通路實現增強免疫應答能力（Huang等，2022）。 而發酵杜仲葉通過何種方式和信號通路調控動物免疫力尚有待深入研究。

3 杜仲葉發酵在生產中的應用

3.1 杜仲葉發酵在食品方面的應用 杜仲葉具有食用習慣，可用于炒菜、煮粥、飲茶或榨汁加入面團等。 毒理學試驗也證實了杜仲葉的食用安全性，其在食品方面得到了應用開發（龔頻等，2022）。 通過發酵工藝杜仲葉制品能夠更符合消費者的期望，以發酵飲品類為主。 張麗華等（2019b）采用冠突散囊菌發酵杜仲葉，在最佳工藝條件下，即接種量20%、含水量35%、渥堆溫度45 ℃、渥堆時間3 h、發酵時間為8 d，制得香味濃郁的杜仲茶，其綠原酸含量為0.478 mg/g。徐青梅等（2021）以杜仲葉與新鮮茶葉為主要原料，優化發酵條件等工藝，研制出滋味醇和、風味俱佳的杜仲葉復合工夫紅茶。在其他飲品方面，張麗華等（2019a）利用植物乳桿菌對杜仲鮮葉進行發酵， 以低聚木糖為糖源使其具有更優的活菌數， 為杜仲葉活菌型發酵飲料的開發提供參考。 同時，添加適量杜仲葉制備的發酵醋具有良好的風味（Jia 等，2019；周琳娜等，2012）。目前，陜西、湖南、廣西、江西、河北等省份已經開展杜仲葉即是食品又是中藥材的試點工作。

3.2 杜仲葉發酵在飼料方面的應用 發酵是飼糧生產中常用的生產工藝， 通過微生物發酵可有效降低飼料中的抗營養因子，生成大量有機酸、小肽、氨基酸、酶以及各種代謝產物，改善飼料適口性， 促進動物對營養成分的消化吸收 （趙瑩等，2022）。在動物飼料添加一定量的杜仲葉粉經微貯后制備出發酵飼料， 能夠有效提高飼料的品質和營養價值， 提升動物飼料養分消化率和利用價值（表1）。 譚世圖等（2020）在玉米秸稈發酵飼料中添加杜仲粉， 表明適宜量的杜仲粉可以有效提高飼料中非蛋白氮（PA）含量，降低結合蛋白（PC）含量，進而提高飼料的消化利用率。在花生秧和紅薯秧微貯飼料中結果一致， 表明發酵過程中杜仲粉能夠有效提高飼料蛋白品質， 并能夠起到改善飼料質地和氣味的作用（楊樂赟等，2022；平偉夢等，2021）。 同時，飼糧中添加杜仲發酵產物能夠改善肉品質，在一定程度上改善氨基酸和脂肪酸含量，并對肌肉pH、滴水損失、蒸煮損失和剪切力產生影響，進而改善肉色、嫩度、多汁性及風味（曹銀娣等，2021；彭密軍等，2019；段明房等，2018）。 近年來，隨著綠色飼料添加劑及其產業發展迅速，發酵杜仲葉飼料具有廣闊的市場前景。

表1 發酵杜仲葉在動物飼料中的應用

4 總結與展望

目前， 生物發酵技術的研究已經受到廣泛關注（王聰聰等，2022）。 發酵杜仲葉的成分、功效和用途等方面發生了不同程度的變化（圖1）。 杜仲葉經過發酵后， 其粗蛋白質和氨基酸含量均呈現不同程度的提高，而黃酮、綠原酸、多酚等活性物質也隨著發酵產生不同程度的變化。 同時， 發酵能夠改善杜仲葉中呈香味揮發性物質， 從而提高產品品質。發酵杜仲葉中各組分物質含量與菌株、發酵時間、工藝等密切相關。作為我國重要的木本藥用植物， 杜仲葉含有的活性成分可能會對發酵菌株生長產生影響， 造成發酵難度的增加和工藝的復雜性。因此，對于杜仲葉發酵專用菌株仍需開展深入研究，尤其是杜仲內生菌的鑒定和篩選。杜仲葉和發酵杜仲葉及提取物作為飼料添加劑已經得到應用， 但其通過何種調控機制提高動物抗氧化性和免疫性等尚有待深入研究。此外，杜仲葉即是食品又是中藥材的試點工作已經在多個省份開展，杜仲葉迎來了快速發展機遇。發酵杜仲葉在食品中應用還是過于單一， 加工過程中有效成分的變化規律及其影響因素還不明確， 其安全性還有待全面深入研究。 杜仲葉發酵使其揮發性和非揮發性成分發生變化，目前尚未標準化，可根據實際生產需求建立杜仲葉發酵生產技術規程， 促進杜仲葉發酵相關產業高質量發展。

圖1 杜仲發酵葉研究進展及應用