槲皮萬壽菊素對產蛋后期蛋雞生產性能、蛋品質、抗氧化和脂質沉積的影響

周帥帥， 劉家言， 趙鵬宇， 楊慶林， 趙 劍 ， 伏雨欣， 吳 昊， 李 垚

（1.東北農業大學動物科學技術學院,黑龍江 哈爾濱 150030；2.河北省植物源動物保健品技術創新中心，河北 邯鄲 057250；3.晨光生物科技集團股份有限公司，河北 邯鄲 057250）

萬壽菊在我國種植面積達上百萬畝， 主要用于提取葉黃素， 提取后的萬壽菊渣中槲皮萬壽菊素（QG）含量豐富，被廢棄造成資源浪費（郭耀東，2019）。 因此，實現萬壽菊資源充分利用，明確QG功效和應用效果會產生很大的經濟和社會意義。研究表明，適量QG 能顯著提高肉雞體增重，降低肉雞的料肉比（鄭旭等，2022；張毅峰等，2020）。日糧添加3.75 mg/kg QG 可以顯著降低肉雞血清甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）含量，對血清總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）含量均無顯著影響（張毅峰等，2020）。

目前蛋雞生產中的主要問題是產蛋后期蛋雞生產性能和蛋品質下降、蛋黃膽固醇含量較高、蛋黃磷脂和卵磷脂含量較低， 開發提高產蛋后期蛋雞產蛋性能并改善蛋品質的飼料添加劑具有指導意義。而黃酮類化合物具有提高蛋雞生產性能、改善蛋品質的作用，QG 屬于黃酮類化合物， 但QG在蛋雞生產中的應用效果鮮見報道，因此，為了探討QG 對產蛋后期蛋雞的產蛋性能和蛋品質的作用及機制，本試驗對產蛋后期蛋雞生產性能、蛋品質、脂質、抗氧化等相關指標進行檢測，為QG 作為一種新型飼料添加劑的研究與開發提供科學的數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗材料 試驗動物：385 日齡海賽克斯蛋雞，購自哈爾濱益農禽業。 試驗材料：槲皮萬壽菊素純度80%（HPLC），河北晨光生物科技有限公司提供，以粉劑的形式拌料添加。

1.2 試驗設計 試驗選用480 只385 日齡海賽克斯蛋雞，隨機分為4 組，每組6 個重復，每個重復20只雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧，試驗組基礎飼糧額外添加0.32%、0.48%、0.64%QG， 試驗期10 周， 玉米-豆粕型基礎飼糧參照我國2020 年蛋雞營養需要配制，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

1.3 飼養管理 試驗雞舍為3 層階梯籠養，采用人工光照和自然光照相結合的方法， 每天光照16 h，自然通風，自由飲水、采食。每天08：00、16：00兩次喂料。 每天16：00 撿蛋1 次、除糞一次。

1.4 樣品采集 試驗開始后分別于第4 周和第10 周記錄、稱重，收集雞蛋，從每個重復中選取一只蛋雞，進行翅靜脈采血，靜置4 h，3000 r/min 離心15 min 制備血清，-20 °C 保存。采血后，進行頸靜脈放血處死， 解剖得到肝臟樣品，-80 ℃凍存，測定前使用勻漿機制備肝臟勻漿液備用。

1.5 指標測定及方法

1.5.1 生產性能 生產性能計算公式如下：

產蛋率/%=每組產蛋數/蛋雞數量×100；

平均日采食量=蛋雞耗料量/天數；

平均蛋重=每組總蛋重/總蛋數；

料蛋比=采食量/平均蛋重。

1.5.2 蛋品質 （1）蛋殼強度：用蛋殼強度測定儀檢測；（2）蛋殼厚度：用蛋殼厚度測定儀分別測定蛋的大頭、小頭、中間部分的蛋殼厚度，然后取平均值；（3）蛋白高度：用蛋形指數測定儀讀出蛋白高度；（4）蛋黃顏色：將蛋黃和蛋清分離，在熒光燈下比色，統計各級的數量取其平均值；（5）哈氏單位：避開蛋白系帶，用蛋白高度測定儀測量濃蛋白層3 個等距離點的蛋白高度， 求平均值并按照公式計算哈氏單位。

哈氏單位=100×lg（H-1.7×W0.37+7.6）；

式中：H 為所測雞蛋的濃蛋白高度；W 為所測雞蛋的蛋重。

蛋黃指數=蛋黃重/全蛋重×100。

1.5.3 抗氧化指標、肝臟脂質、血清激素、血清細胞因子 肝臟和血清超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px）、 過氧化氫酶（CAT）的活性、總抗氧化能力（T-AOC）以及丙二醛（MDA）含量、肝臟TG 和TC 含量、血清雌激素（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、生長激素（GH）、胰島素樣生長因子-I（IGF-I）含量、血清白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素6（IL-6）、轉化生長因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量， 采用江蘇寶萊生物的試劑盒嚴格按照說明書進行檢測。

1.5.4 血脂 采用全自動生化分析儀測定血清甘油三酯（TG）、血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）和高密度脂蛋白（HDL）含量。

1.5.5 蛋黃脂質

1.5.5.1 蛋黃總磷脂（PL）標準曲線的繪制 按要求配制P 標準溶液，在420 nm 波長下，用紫外分光光度計測不同濃度溶液的吸光度。 以磷含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準方程及線性相關系數。 樣品液制備以及樣品測定：每個重復隨機挑選5 枚雞蛋，用蛋黃分離器將蛋黃蛋清分離，將蛋黃放入潔凈的燒杯中，準確稱取2 g 蛋黃，釆用乙醚-乙醇混合溶液提取鮮蛋黃中磷脂，然后加酸將提取物中有機物破壞，使P游離出來，在酸性溶液中用釩鉬酸銨顯色，在分光光度計上于420 nm 處測定， 根據P 含量換算成磷脂含量，換算公式如下：

式中：Y 為蛋黃總磷脂含量，%；25 為磷-磷脂系數；X 為P 的含量；2 為樣品重；50 為稀釋倍數（Shi，2013）。

1.5.5.2 蛋黃卵磷脂（LEC）標準液的測定和標準曲線的繪制 按要求配制卵磷脂標準液，在292 nm處分別測定不同濃度溶液的吸光度。 以標準品溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準方程及線性相關系數。 樣品液制備：從每個重復中隨機選取5 枚雞蛋， 用蛋黃分離器將蛋黃蛋清分離，將蛋黃放入潔凈的燒杯中，準確稱取5 g 蛋黃，加入15 mL 的丙酮，室溫下在磁力攬拌器下攪拌20 min 后過濾出油脂層，丙酮潤洗至無色，傾出丙酮。將盛有丙酮不溶物的燒瓶置于電熱恒溫箱中，60 ℃恒溫30 min， 揮發掉殘余丙酮。 然后向燒瓶中加入25 mL 無水乙醇，40 ℃下攪拌90 min，液體過濾，取出濾液。 攪拌結束后，將樣品液轉移到100 mL 容量瓶中， 用無水乙醇定容至刻度。然后將溶液3000 r/min 離心10 min，待用。 樣品測定： 取各樣品濾液1.00 mL 分別于25 mL 容量瓶中， 其他步驟同標準曲線測定方法，根據標準曲線可得對應卵磷脂的濃度值， 最后換算成樣品中卵磷脂的百分含量（Ting，2011）。

1.6 數據統計分析 試驗數據采用“平均值±標準誤”表示，數據分析分別采用SPSS 19.0 統計軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）和鄧肯氏多重比較（Duncan），P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 QG 對蛋雞生產性能的影響

2.1.1 QG 對蛋雞產蛋率的影響 由表2 可知，試驗期1 ～4 周、1 ～10 周，槲皮萬壽菊素對蛋雞產蛋率和料蛋比有顯著影響；其中，1 ～10 周蛋雞產蛋率分別顯著提高12.25%、8.48%、10.21%（P＜0.05）。槲皮萬壽菊素對5 ～10 周產蛋率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 QG 對產蛋后期蛋雞產蛋率的影響 %

2.1.2 QG 對蛋雞料蛋比的影響 由表3 可知，與對照組相比，試驗期1 ～4 周，三水平QG 組蛋雞料蛋比均顯著降低 （P＜0.05），1 ～10 周，0.32%和0.64%槲皮萬壽菊素組料蛋比顯著降低10.32%、9.96%（P＜0.05），但三水平QG 組之間料蛋比差異不顯著（P＞0.05）；試驗期5 ～10 周，三水平QG 對料蛋比沒有顯著影響（P＞0.05）。

表3 QG 對產蛋后期蛋雞料蛋比的影響

2.1.3 QG 對蛋重和日采食量的影響 由表4、表5 可知，與對照組相比，所有試驗期內，三水平QG對蛋雞平均蛋重和平均日采食量均無顯著影響（P＞0.05）。

表4 QG 對產蛋后期蛋雞平均蛋重的影響g

表5 QG 對產蛋后期蛋雞平均日采食量的影響g

2.2 QG 對蛋雞蛋品質的影響 與對照組相比，飼喂4 周槲皮萬壽菊素，0.32%槲皮萬壽菊素組蛋白高度、 哈氏單位分別顯著提高23.36%、14.23%（P＜0.05），蛋殼厚度顯著降低6.11%（P＜0.05），三水平QG 對雞蛋蛋黃顏色、蛋殼強度無顯著影響（P＞0.05）（表6）。 飼喂10 周槲皮萬壽菊素，0.48%、0.64%槲皮萬壽菊素組雞蛋蛋殼厚度顯著降低7.24%、12.33%（P＜0.05）， 其他指標各組均無顯著差異 （P＞0.05）（表7）。 從蛋白高度、哈氏單位、蛋黃指數來看，飼喂4 周QG 對蛋品質的改善效果比飼喂10 周好。

表6 QG 飼喂4 周對產蛋后期蛋雞蛋品質的影響

表7 QG 飼喂10 周對產蛋后期蛋雞蛋品質的影響

2.3 QG 對蛋雞抗氧化指標的影響 與對照組相比，飼喂4 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素組蛋雞肝臟SOD 活性顯著提高149.43%、138.20%、38.76%（P＜0.05），0.32%、0.48%QG 組血清SOD 活性顯著提高70.22%、73.68%（P＜0.05）， 肝臟MDA 含量顯著降低51.92%、41.05%（P＜0.05）， 0.48%、0.64%槲皮萬壽菊素組肝臟T-AOC 顯著增加77.74%、50.77%（P＜0.05）（表8）；飼喂10 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素肝臟和血清SOD 活性顯著提高131.60%、100.50%、45.62%和104.52%、87.46%、26.01%，肝臟T-AOC 顯著提高21.73%、48.59%、56.05%（P＜0.05）， 血清和蛋黃MDA 含量顯著降低40.02%、27.57%、15.85%和51.60%、35.46%、15.34%（P＜0.05）（表9）。 從肝臟和血清GSH-Px、SOD、CAT、MDA、T-AOC 和蛋黃MDA 來看，飼喂4 周QG 提高產蛋后期蛋雞抗氧化性能較飼喂10 周更好。

表8 QG 飼喂4 周對產蛋后期蛋雞抗氧化指標的影響

表9 QG 飼喂10 周對產蛋后期蛋雞抗氧化指標的影響

2.4 QG 對蛋雞血脂的影響 與對照組相比，飼喂4 周槲皮萬壽菊素， 三水平槲皮萬壽菊素組血清TG、HDL 含量顯著降低45.32%、34.88%、12.06%和40.09%、33.85%、11.21%（P＜0.05）（表10）；飼喂10 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素血清TG 含量顯著降低37.18%、34.59%、10.93%， 血清HDL 含量顯著提高116.08%、100.97%、32.82%（P＜0.05），0.32%、0.48%槲皮萬壽菊素組血清TC、LDL、VLDL 含量顯著降低 （表11）。 從血清TG 來看，飼喂4 周QG 對產蛋后期蛋雞降血脂的效果較飼喂10 周更明顯。

表10 QG 飼喂4 周對產蛋后期蛋雞血脂的影響

表11 QG 飼喂10 周對產蛋后期蛋雞血脂的影響

2.5 QG 對蛋雞肝臟和蛋黃脂質含量的影響與對照組相比，飼喂4 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素組蛋雞肝臟TG、TC 含量顯著降低，0.32%、0.48%槲皮萬壽菊素組蛋黃TG、TC 含量顯著降低39.03%、29.30%和34.75%、26.01%（P＜0.05）， 0.48%、0.64%槲皮萬壽菊素組蛋黃LEC 含量顯著提高43.97%、38.13%（P＜0.05）（表12）；飼喂10 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素組肝臟TG 和TC、 蛋黃TG 和TC、 蛋黃PL 和LEC含量均顯著降低（P＜0.05）（表13）。 從肝臟TC、蛋黃TG、TC、蛋黃PL、LEC 來看，飼喂10 周比飼喂4 周效果好。

表12 QG 飼喂4 周對產蛋后期蛋雞肝臟和蛋黃脂質含量的影響

表13 QG 飼喂10 周對產蛋后期蛋雞肝臟和蛋黃脂質含量的影響

2.6 QG 對蛋雞血清激素含量的影響 與對照組相比，飼喂4 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素組FSH、T3 含量分別顯著提高46.25%、75.41%、61.02%和74.89%、43.38%、78.08%（P＜0.05），0.32%槲皮萬壽菊素組E2、LH 和IGF-1含量分別顯著降低38.13%、20.21%和51.30%（P＜0.05）（表14）；飼喂10 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素組LH 含量顯著提高81.10%、128.21%、51.03%，T3 含量顯著降低49.37%、41.66%、13.23%（P＜0.05），0.32%槲皮萬壽菊素組 T4、GH、IGF -1 分別顯著降低 43.24% 、34.41%、43.62%，FSH 顯著提高48.79%（P＜0.05）（表15）。 從血清FSH、T3、T4 來看， 飼喂QG 4 周比飼喂10 周更好。

表14 QG 飼喂4 周對產蛋后期蛋雞血清激素含量的影響

表15 QG 飼喂10 周對產蛋后期蛋雞血清激素含量的影響

2.7 QG 對蛋雞血清細胞因子含量的影響 與對照組相比， 飼喂4 周槲皮萬壽菊素，0.32%QG 和0.48%QG 組IL-6、TNF-α 含量分別顯著降低38.85%、29.21%和48.47%、40.67%，IL-4 含量分別顯著提高110.37%、85.74%， 三水平槲皮萬壽菊素組TGF-β 含量較對照組均顯著降低（P＜0.05）（表16）；飼喂10 周槲皮萬壽菊素，三水平槲皮萬壽菊素均可顯著影響IL-4、TNF-α、TGF-β 水平，而0.32%QG 組效果更明顯，0.32%QG 和0.48%QG 組IL-6 分別顯著降低42.72%、27.73%（P＜0.05）（表17）。 從血清IL-4、IL-6、TNF-α 來看，飼喂4 周QG比飼喂10 周抗炎效果好。 從蛋黃TG 和TC、 蛋黃PL 和LEC 來看，飼喂10 周QG 比飼喂4 周好。

表16 QG 飼喂4 周對產蛋后期蛋雞血清細胞因子含量的影響pg/mL

表17 QG 飼喂10 周對產蛋后期蛋雞血清細胞因子含量的影響pg/mL

3 討論

3.1 QG 對產蛋后期蛋雞生產性能的影響 通常用蛋雞產蛋率、料蛋比、平均蛋重、平均日采食量反映蛋雞的生產性能。 Liu 等（2014）試驗證明，槲皮素能提高蛋雞的產蛋率。 飼料添加適量大豆黃酮能顯著提高蛋雞產蛋率，降低料蛋比（Shi 等，2013）。本試驗證明適量QG 能顯著提高蛋雞產蛋率，降低料蛋比，進而提高蛋雞生產性能，與大多數黃酮類化合物對蛋雞的作用效果一致。

蛋雞生產性能受下丘腦-垂體-性腺軸的調控， E2、LH、FSH、GH、IGF-I、T3 和T4 等多種激素與其密切相關 （Hewitt 等，2010；Ciccone 等，2005；Cos 等，2003）。Liu 等（2014）試驗結果表明，飼料添加0.4 g/kg 槲皮素能顯著提高蛋雞血清E2、FSH、LH 含量，進而提高蛋雞的產蛋率。 周玉傳等（2002）試驗證明，飼料添加適量大豆黃酮能顯著提高鴨產蛋率、血清GH、IGF-I 水平，進而提高鴨生產性能。朱新建等（2004）試驗證明，飼料添加適量大豆黃酮能顯著提高蛋雞血清T3、T4 水平， 提示黃酮類化合物能通過提高蛋雞血清T4水平， 進而提高蛋雞的生產性能。 本試驗結果顯示， 飼喂QG 能顯著提高蛋雞血清E2、FSH、LH、GH、IGF-I、T3、T4 含量，進而提高蛋雞生產性能，提示QG 與其他黃酮類化合物一樣， 能通過調控血清激素水平進而提高蛋雞的生產性能； 同時發現， 飼喂4 周QG 蛋雞血清E2 含量高于飼喂10周， 可能是由于第10 周QG 蛋雞血清E2 水平下降明顯， 添加QG 的弱刺激素樣作用不足以阻止E2 的下降，因而提高產蛋率的效果不如飼喂4 周QG。

3.2 QG 對產蛋后期蛋雞蛋品質的影響 蛋白高度、蛋殼強度、蛋殼厚度、破軟殼率、哈氏單位、蛋黃顏色、 蛋形指數是反映蛋雞雞蛋蛋品質的重要指標。 Liu 等（2013）試驗證明，飼喂槲皮素能提高產蛋后期蛋雞雞蛋蛋殼厚度、 蛋殼強度和哈氏單位。本試驗結果顯示，飼喂QG 能顯著提高蛋雞雞蛋蛋白高度、哈氏單位、蛋形指數，顯著降低破軟殼率，提示QG 與其他黃酮類化合物相同，可以改善蛋雞蛋品質。

肝臟和血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、CAT 可反映蛋雞的抗氧化性能。 試驗證明橙皮素和柚皮素可以提高蛋雞血清SOD、CAT 活性（Ting等，2011；Lien 等，2008）。 Li 等（2022）試驗證明，飼料添加柚皮苷可以提高血清GSH-Px、CAT、SOD 活性和T-AOC， 降低MDA 含量。 韓立明等（2010）試驗證明，大豆異黃酮能顯著提高肥育豬血漿SOD、CAT 和GSH-Px 活性和T-AOC，顯著降低MDA 含量。 賈琦珍等（2014）試驗證明，飼料添加適量的小花棘豆黃酮能顯著提高血清和肌肉組織SOD、GSH-Px、CAT 和谷胱甘肽還原酶活性，顯著降低血清MDA 含量。 本試驗結果顯示，飼喂QG 能顯著提高蛋雞血清和肝臟SOD 活性和T-AOC，顯著降低蛋雞肝臟和血清CAT、GSHPx 活性和MDA 含量， 這與其他黃酮類化合物研究結果不完全一致，可能與黃酮化合物的種類、結構、活性、劑量、動物品種有關。

細胞因子是評估機體免疫能力的一個重要指標，在免疫應答中起關鍵作用，常用血清TNF-α、IL-4、IL-6 和TGF-β 反映蛋雞免疫力。 Han 等（2002）試驗證明，大豆異黃酮能顯著提高小鼠血清IL-4 含量和IL-4 基因表達水平。 Horng 等（2017）試驗證明，桑葉多酚能降低炎癥細胞因子的產生，抑制NF-κB 信號通路，從而調控炎癥反應。 本試驗結果顯示，QG 能顯著提高蛋雞血清IL-4 含量， 顯著降低血清IL-6、TNF-α 含量，低水平血清TNF-α 和高水平IL-4 能避免NF-κB活化，提示QG 可能具有抗炎癥作用。

3.3 QG 對產蛋后期蛋雞脂質的影響

3.3.1 QG 對產蛋后期蛋雞血脂的影響 血清TG、TC、LDL、HDL、VLDL 含量反映了蛋雞血脂水平。 劉紅南等（2014）試驗證明，0.04%槲皮素可顯著降低蛋雞血清TG、TC、LDL-C。趙鳳歧等（2008）在飼料中添加適量大豆黃酮能顯著降低蛋雞血脂。Feng（2017）等試驗證明，飼料中添加適量白藜蘆醇可顯著降低蛋雞血脂。 Lien 等（2008）和Ting等（2011）試驗證明，飼料添加槲皮素能降低蛋雞血脂，可能是由于槲皮素能抑制HMG-輔酶A 還原酶活性的作用。 Lien 等（2008）試驗證明，飼料添加橙皮苷和槲皮素能降低血清膽固醇。 本試驗結果進一步證實了QG 與其他黃酮類化合物同樣具有降低蛋雞血脂的作用。

3.3.2 QG 對產蛋后期蛋雞肝臟和蛋黃脂質含量的影響 肝臟和蛋黃TG、TC， 蛋黃PL、LEC 均可反映蛋雞脂質代謝狀態。徐國銀（2007）證明，大豆黃酮能降低蛋黃膽固醇含量。 呼林林等（2013）證明，0.02%、0.04%槲皮素可極顯著降低蛋黃TC 含量。尹靖東等（2004）證明，大豆黃酮能顯著降低蛋黃TC，對肝臟TC 有降低趨勢。Iskender 等（2017）證明， 飼料添加橙皮苷和槲皮素均能降低蛋黃膽固醇。本試驗結果顯示，飼喂QG 顯著降低肝臟和蛋黃TG、TC 含量， 提示QG 可能通過提高血清E2 含量，影響雌激素與下丘腦和垂體雌二醇受體的結合，調節雌激素活性，影響神經內分泌系統生長軸，從而影響蛋雞的膽固醇代謝。 Hu（2013）發現，適量的槲皮素可顯著提高蛋黃PL 含量。 本試驗結果顯示， 飼喂QG 可顯著降低蛋雞蛋黃LEC和蛋黃PL 含量， 與其他黃酮類化合物研究結果不一致，其原因有待于進一步研究。

4 結論

本試驗結果表明，短期飼喂適量的QG 提高生產性能、改善蛋品質、降低脂質沉積的效果比長期飼喂明顯， 本試驗條件下，QG 的最適添加量為0.32%。