血滿草葉中綠原酸提取工藝優化及抗氧化活性

郭 蒙 ， 姜春紅， 劉 韜， 王玉林， 勾 娜 ， 羅小虎，3

（1.黔南民族師范學院化學化工學院，貴州 都勻 558000；2.方拓生物科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州 215100；3. 貴州省高等學校材料失效與防護工程研究中心，貴州 都勻 558000）

綠原酸是植物體內有氧代謝的一種苯丙素類化合物。 具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、保肝利膽、 調節糖和脂代謝等多種生物學活性功能（Bagdas 等，2020；梁永鋒等，2018），在食品、化工、醫藥保健、飼料添加劑等方面都有應用（卓春柳等，2019；Santana-Gálvez 等，2017）。 據文獻報道， 在畜禽養殖和畜牧生產中添加綠原酸類化合物，可有效改善肉的品質（丁浩軒等，2020），提高動物生長速率及繁殖能力，降低腹瀉率，提高精液低溫保存效果， 增強動物免疫功能等 （王璐等，2022；萬凡等，2021；謝凱桓等，2021；劉靜慧等，2020）。 如朱原等（2020）研究發現，甜葉菊中綠原酸與布氏乳桿菌協同發酵可促進雛雞腸道改善；不同日齡蛋雛雞添加甜葉菊綠原酸， 可改善盲腸菌群，并增強其機體免疫力（卓春柳等，2021）；劉靜慧等（2021）發現，在肉兔飼料中添加綠原酸可改善其空腸結構形態， 提高生長性能； 張昊雪等（2022）發現，綠原酸還可抑制牛大腸桿菌和沙門氏菌。 食品中加入綠原酸還可起到保鮮防腐護色效果，如南美白對蝦中加入綠原酸，可以保鮮（謝伊莎等，2021）； 飲料果汁中添加綠原酸具有防腐增色作用等（王云云等，2021）。

接骨木屬植物血滿草（Sambucus adnataWall.ex DC.），又稱接骨丹、血管草、紅山花、苛草等，其莖折斷明顯可見有紅色液體流出， 主要分布在西藏、寧夏、貴州、云南等地，在藏族、傣族、彝族、哈尼族等少數民族中作為藥用植物歷史悠久（楊增明等，2007）。 血滿草具有活血散瘀、祛風濕、利尿等藥效，亦可用于跌打損傷、急慢性腎炎、風疹瘙癢等（沈笑媛等，2006）。臨床應用方面血滿草熱浴可局部治療新生兒硬腫癥（王鳳瓊等，2009）；血滿草為主要成分生產的制劑有傣藥關通舒膠囊和關通舒口服液（劉向榮等，2005）。

研究報道血滿草中含有萜類、黃酮類、醇類、木脂素類、 酚酸類、 脂肪酸類等化合物 （Li 等，2021；李巧月等，2019；劉冬麗等，2018）。 袁蕾等（2020）以純化水和雙水相K2HPO4、PEG6000 萃取體系為提取溶劑， 對血滿草中多糖提取工藝進行了優化，并明確純水提取溶劑中多糖的單糖組分。王文靜等（2010）發現，血滿草的水提物和醇提物對小白鼠灌服具有抗炎鎮痛作用。Yuan 等（2020）從血滿草葉子中純化出的一種中性多糖可通過激活巨噬細胞和增強宿主免疫系統功能發揮免疫調節作用。但對于血滿草中綠原酸的提取鮮有報道。本試驗通過以單因素試驗和Box-Behnken 試驗設計， 旨在確定血滿草葉子中綠原酸提取的最佳條件，同時對其抗氧化活性進行分析，為血滿草資源的開發應用提供一定的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 T6 新世紀紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、AR224CN 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、KH2200DE 數控超聲波清洗器（上海滬粵明科學儀器有限公司）。

血滿草葉，采自貴州都勻，自然晾干，粉碎過60 目篩封存保鮮袋內，干燥器內儲存備用。 綠原酸對照品、維生素C 對照品（Vc），純度≥98%，合肥博美生物科技有限責任公司；2，2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），合肥巴斯夫生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸提取工藝流程 血滿草葉粉末→加提取溶劑→超聲→離心→綠原酸提取液→稀釋→紫外分光光法測定→計算。

1.2.2 標準曲線制作 移取一系列不同體積的0.1 mg/mL 綠原酸對照溶液， 加無水乙醇稀釋定容，參考梁潔怡等（2021）制作綠原酸標準曲線，得回歸方程為A=51.0173C-0.0042（R2= 0.9973）。

1.2.3 綠原酸提取率 移液槍吸取0.4 mL 樣品提取液，置于10 mL 量瓶，根據1.4 方法測定，用下列公式計算血滿草中綠原酸提取率。

式中：Y為血滿草葉中綠原酸提取率，%；c為綠原酸濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為樣品提取液體積，mL；m為血滿草葉粉末質量，g。

1.3 單因素試驗 單因素試驗設計見表1。

表1 單因素試驗設計

1.4 響應面優化血滿草葉中綠原酸因素與水平依照單因素試驗結果， 確定最高綠原酸提取率的四個單因素參數， 作為響應面試驗優化血滿草葉中綠原酸的零點水平，進行四因素三水平的Box-Behnken 試驗設計（表2）。

表2 Box-Behnken 試驗因素及水平

1.5 血滿草葉中綠原酸抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH 自由基清除活性測定 分別配制0.20 mmol/L DPPH 乙醇溶液、不同濃度的血滿草葉提取液和Vc 溶液（王翔等，2018）。 避光環境下，分別移取無水乙醇、 不同濃度的血滿草葉提取液或Vc 溶液2 mL， 加2 mL DPPH 乙醇溶液與其混合，37 ℃水浴30 min，517 nm 處測其吸光度， 各記為A1和A2。 DPPH 自由基清除率按下列公式計算。

1.5.2 ABTS 自由基清除活性測定 7.4×10-3mol/L ABTS 和2.6×10-3mol/L 過硫酸鉀水溶液取相同體積混合，避光保存12 h 待用（Thaipong 等，2012）。試驗時配制成734 nm 下吸光度為（0.70±0.02）的工作液。 分別移取0.4 mL 無水乙醇或不同濃度綠原酸提取液與3.6 mL ABTS 工作液混合，37 ℃水浴6 min，734 nm 處測其吸光度，各記為A’1和A’2。ABTS 自由基清除率按下列公式計算。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對血滿草葉中綠原酸提取率的影響 由圖1 可見，綠原酸提取率呈先升后降趨勢，35%乙醇濃度時綠原酸提取率達到2.03%， 可能是因為乙醇濃度增大，溶劑極性降低，其他親脂性雜質大量溶出的同時， 血滿草葉中綠原酸溶出會隨之減少（趙俊宏等，2021），因此試驗采用體積分數為35%的乙醇溶液。

圖1 乙醇濃度對血滿草葉中綠原酸提取率的影響

2.2 液料比對血滿草葉中綠原酸提取率的影響如圖2 可見，液料比40：1（mL/g）時血滿草葉中綠原酸提取率達到最大2.25%，之后開始下降。可能是液料比小時， 增大乙醇溶液的量會加速溶質傳質，有利綠原酸的溶出，繼續增加乙醇溶液時，醇溶性雜質會大量溶出，阻礙了綠原酸的溶出（許丹丹等，2020）。因此試驗采用液料比為40：1（mL/g）。

圖2 液料比對血滿草葉中綠原酸提取率的影響

2.3 超聲時間對血滿草葉中綠原酸提取率的影響 如圖3 可見，隨超聲時間增長，血滿草葉中綠原酸提取率呈先增后減趨勢，45 min 時達到最大值。 可能是因為提取時間的延長導致綠原酸被氧化、分解、結構被破壞或者雜質含量的增加，從而使綠原酸提取率下降（趙俊宏等，2021）。因此試驗超聲時間為45 min。

圖3 超聲時間對血滿草中綠原酸提取率的影響

2.4 超聲溫度對血滿草葉中綠原酸提取率的影響 如圖4 可見， 隨超聲溫度升高血滿草葉中綠原酸提取率呈先增后急劇減小趨向，60 ℃時達到最大值。 這可能是因為綠原酸含有鄰二酚羥基不穩定結構，在高溫條件下，易被氧化，從而降低血滿草葉中綠原酸提取率。 因此試驗超聲溫度為60 ℃。

圖4 超聲溫度對血滿草中綠原酸提取率的影響

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 響應面試驗設計 用Design Expert11.0 軟件對表2 進行Box-Behnken 分析，所得試驗結果見表3。 模型優化的數學回歸方程為：Y= 2.21-0.1017A-0.0008B-0.3067C+0.1075D-0.2350AB-0.1425AC-0.0125AD+0.0425BC+0.0750BD-0.1450 CD-0.2102A2-0.1265B2-0.3977C2+0.1360D2。

2.5.2 響應面試驗方差分析 方差分析結果見表4。 模型P值＜0.0001；失擬項P值0.2390＞0.05，說明此試驗模型選擇合適，在此試驗條件下，對血滿草葉中綠原酸提取率進行測定。 變異系數CV為1.33%， 在有效范圍內。 模型R2=0.9974，Radj2=0.9944，表明此模型與試驗數據的誤差小，99.44%血滿草葉中綠原酸提取率變化可用此試驗模型解釋。由表4 中F值可知，一次項中，除液料比對血滿草葉中綠原酸提取率影響表現為不顯著外，其余三項均為極顯著，影響排序為：C＞D＞A＞B。二次項均為極顯著。 交互項中除AD 項外，其余均極顯著。

表4 方差分析

2.5.3 交互項作用分析 經表3 響應面數據分析可得交互項的3D 曲面和等高線變化圖，3D 曲面圖呈拱形或坡度陡峭時，等高線分布的越密，呈橢圓形或馬鞍形時，交互項作用影響就越顯著（曹艷華等，2020）。 由圖5 可知，AB、AC、BC 交互項的曲面圖坡度較陡峭， 等高線密集并呈典型的橢圓形，因此AB、AC、BC 交互項對血滿草葉中綠原酸的提取率影響最顯著。由AD 項3D 曲面圖和等高線可得，隨著超聲溫度的升高，血滿草葉中綠原酸的提取率呈緩慢上升趨勢；隨著乙醇濃度的升高，血滿草葉中綠原酸的提取率先緩慢上升至最高點再稍下降，曲線變化較為平滑，說明AD 之間交互作用較小。 BD、CD 交互項的3D 曲面圖坡度相對較峻峭，等高線較密集且呈馬鞍形，因此BD、CD交互項對血滿草葉中綠原酸的提取率影響顯著。由圖5 分析可知， 結果與方差分析表3 中數據相一致。

圖5 交互項對血滿草葉中綠原酸提取率影響的響應面及等高線圖

2.5.4 響應面最佳工藝試驗條件驗證 由軟件Design Expert 對表3 數據優化分析得提取血滿草葉中綠原酸的最佳工藝參數， 其乙醇濃度、 液料比、超聲時間、超聲溫度分別為29.91%、46.92：1（mL/g）、40.61 min、70.00 ℃，此血滿草葉中綠原酸提取率預測值為2.61%。 為驗證預測結果的有效性和可行性， 實際操作最佳工藝采用乙醇濃度30%、液料比45：1（mL/g）、超聲時間40 min、超聲溫度70 ℃，平行試驗三次得到血滿草葉中綠原酸的提取率平均值為2.55%，與該試驗預測值相近，說明此試驗模型適合血滿草葉中綠原酸的提取。

2.6 血滿草葉中綠原酸抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH 自由基清除活性 如圖6 所示，在10 ～60 mg/L 試驗濃度范圍內， 血滿草葉中綠原酸提取液與DPPH 自由基清除率呈正相關，Vc 溶液的DPPH 自由基清除率明顯高于綠原酸提取液，Vc 溶液和綠原酸提取液IC50值分別為18.4 mg/L 和59.7 mg/L， 說明提取液中的綠原酸對DPPH 自由基有一定的清除作用。

2.6.2 ABTS 自由基清除活性 如圖7 所示，在5～30 mg/L 試驗濃度范圍內，血滿草葉中綠原酸提取液與ABTS 自由基清除率呈正相關，且Vc 溶液的ABTS 自由基清除能力較強。 綠原酸提取液濃度為30 mg/L 時，ABTS 自由基清除率達到61.5%。 Vc 溶液和綠原酸提取液的IC50值分別為6.5 mg/L 和23.0 mg/L，因此血滿草葉中綠原酸提取液對ABTS 自由基有一定的清除作用。

圖7 ABTS 自由基清除能力

3 結論

采用超聲輔助乙醇浸取法對血滿草葉中綠原酸提取條件進行研究， 依照單因素和響應面優化試驗得最佳工藝條件為乙醇濃度30%、 液料比45：1（mL/g）、超聲時間40 min、超聲溫度70 ℃，此條件下血滿草葉中綠原酸的提取率達到2.55%。體外抗氧化能力研究表明， 血滿草葉中綠原酸具有一定清除自由基作用，但Vc 對DPPH、ABTS 自由基的清除能力更強。