超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中的喹烯酮

王 鑫， 楊發(fā)樹， 杜雪莉， 張鳳枰

（1.四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司，四川 成都 610041；2.通威股份有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省水產(chǎn)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610093）

喹烯酮是我國自主研發(fā)的一種喹噁啉類藥物，具有喹噁啉-1，4-二氧化物結(jié)構(gòu)，能夠抑制細(xì)菌DNA 的合成，與喹乙醇和卡巴氧等傳統(tǒng)的噁喹酸類藥物相比，喹烯酮的毒性副作用大大降低。自產(chǎn)品商業(yè)化以來， 其作為有效抗菌的飼料添加劑在國內(nèi)畜禽業(yè)被廣泛使用。 2020 年7 月1 日以來， 隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號、246 號公告的實(shí)施，除了金霉素預(yù)混劑等15 個獸藥產(chǎn)品、拉沙洛西鈉預(yù)混劑等5 個進(jìn)口獸藥產(chǎn)品可作為抗球蟲類藥物飼料添加劑使用外， 飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑 （中藥類除外）的商品飼料。準(zhǔn)確定性定量測定飼料中的喹烯酮具有重要意義，這就對飼料中喹烯酮藥物殘留檢測提出了更高的要求。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀具有高靈敏度、高特異性、檢測時間快速的特點(diǎn)。近年來，顧亮（2010）、劉雪紅（2016）、曹忠君（2020）等采用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中的喹烯酮。本文采用與喹烯酮極性更為相近的提取液進(jìn)行提取， 并且采用正己烷除脂而不使用SPE 小柱凈化，在節(jié)省成本、提高效率的同時保持較高的靈敏度。 目前，飼料中喹烯酮測定的國家標(biāo)準(zhǔn)大多采用農(nóng)業(yè)部2086 號公告-5-2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》完成，由于喹烯酮屬于非極性化合物，而采用極性溶液提取、凈化，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性較差。 本文根據(jù)喹烯酮的理化性質(zhì)，從液相色譜質(zhì)譜條件、樣品提取、凈化方式、檢出限和定量限等方面開展系統(tǒng)研究，旨在建立適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料中喹烯酮?dú)埩舻某咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測方法，為飼料中喹烯酮快速準(zhǔn)確測定提供方法依據(jù)，保障我國飼料的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、試劑和樣品 UPLC-TQD 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 （沃特世公司）；AB204-E電子分析天平（賽多利斯公司）；Allegra 64R 高速冷凍離心機(jī)（貝克曼公司）；渦旋儀（上海金怡公司）；自動化氮吹儀（廈門睿科公司）；超聲清洗儀（昆山潔力美公司）。

乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲酸等（色譜純，四川科隆公司）；喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99.0%，德國Dr 公司）；超純水（美國Millipore 公司）。

豬配合飼料、豬濃縮飼料、肉牛精料補(bǔ)充料、豬復(fù)合添加劑預(yù)混合飼料， 由四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試樣溶液制備 稱取試樣2 g （精確至0.0001 g）于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 提取液（乙腈：乙酸乙酯=50：50），渦旋振蕩2 min，超聲提取10 min，12000 r/min 離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL 離心管中，殘?jiān)性俅螠?zhǔn)確加入10 mL 提取液，重復(fù)提取一次。 合并兩次上清液、混勻備用。 準(zhǔn)確移取1.0 mL 上清液至玻璃氮吹管中， 于50 ℃氮?dú)獯蹈伞?準(zhǔn)確加入1.0 mL 20%乙腈水溶液復(fù)溶，渦旋振蕩20 s；加入3 mL正己烷，渦旋振蕩10 s，轉(zhuǎn)移全部液體至塑料離心管中，12000 r/min 離心3 min。 將下層溶液過0.22 μm 有機(jī)系濾膜，上機(jī)測定。 全程避光操作。

1.2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 稱取5 個空白樣品基質(zhì)，按照1.2.1 中的提取，分別準(zhǔn)確取1 mL 空白基質(zhì)提取溶液于玻璃氮吹管中，準(zhǔn)確移取適量喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于5 個空白基質(zhì)溶液中，于50 ℃氮?dú)獯蹈伞?準(zhǔn)確加入1 mL 20%乙腈水溶液復(fù)溶，渦旋振蕩20 s，加入3 mL 正己烷，渦旋振蕩10 s，轉(zhuǎn)移全部液體至塑料離心管中，12000 r/min離心3 min，將下層溶液過0.22 μm 有機(jī)系濾膜，配制成濃度分別為1.035、2.069、4.138、20.69 ng/mL和103.5 ng/mL 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.3 色譜參考條件 色譜柱：C18柱，2.1 mm×100 mm，1.8 μm；流動相A：乙腈；流動相B：0.2%甲酸水；梯度洗脫程序見表1；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：3 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式： 正離子掃描； 檢測方式： 多反應(yīng)監(jiān)測MRM；毛細(xì)管電壓：3.0 kv；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：350 ℃；去溶劑流速：650 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；定性離子對、定量離子對和對應(yīng)的儀器條件參考值見表2。

表2 定性、定量離子和錐孔電壓、碰撞能量

2 結(jié)果與分析

2.1 喹烯酮的化學(xué)性質(zhì) 從喹烯酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式可以看出，喹烯酮具有喹噁啉環(huán)和苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此該化合物的極性較弱。

使用初始流動相分別配制上機(jī)濃度為1.035、2.069、4.138、20.69 ng/mL 和103.5 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，過濾膜后上機(jī)測定。同時向相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別加入3 mL 正己烷， 渦旋振蕩10 s后離心，取下層液體過濾膜上機(jī)測定。從表3 結(jié)果可以看出， 不同濃度的喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液的響應(yīng)值下降了17% ～23%。 根據(jù)相似相溶原理，該結(jié)果也反映了喹烯酮弱極性的化學(xué)性質(zhì)。

表3 喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液響應(yīng)值

2.2 提取溶液的選擇 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，喹烯酮的主要提取溶劑有乙腈（金曉峰，2019；劉慧慧，2015）、乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）（馬曉年，2020；徐英江，2011）、乙酸乙酯（馬曉年，2020；尹怡，2013）、二氯甲烷-乙酸乙酯（3：1，V/V）（劉文靜，2020）、甲醇-乙腈（1：1，V/V）（丁振華，2013；顧亮，2010）、乙腈-0.1%甲酸水（3：2，V/V）（賈錚，2020；曹忠君，2020；賈濤，2015）。考慮到乙腈是良好的除蛋白劑，同時滲透作用強(qiáng)，能高效提取飼料中的目標(biāo)化合物；喹烯酮作為弱極性化學(xué)物質(zhì)，在乙酸乙酯中具有良好的溶解性，本文采用乙腈、乙酸乙酯和乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）作為提取溶液，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，外標(biāo)法定量，結(jié)果見表4。 喹烯酮在乙酸乙酯中具有良好的溶解性，同時考慮到乙腈的除蛋白和強(qiáng)滲透作用， 故采用乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）作為喹烯酮提取溶劑。

表4 不同提取溶液對喹烯酮的提取效率（n=3）

2.3 提取方式的確定 液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜常見有效的提取方式為渦旋振蕩使樣品與提取液充分混勻接觸、超聲清洗儀超聲提取。本研究對超聲時間和超聲次數(shù)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，超聲2 次， 每次超聲10 min 是最有效的提取方式。 不同提取方式結(jié)果見表5。

表5 喹烯酮在不同提取方式下的回收率（n=3）

2.4 分取體積及凈化方式的確定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析主流的凈化方式主要有正己烷除脂凈化、固相萃取小柱凈化、QuECHERS 快速凈化、免疫親和小柱特異凈化等。 通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，喹烯酮在儀器上的響應(yīng)很高。 因此本文在保證取樣精確度的情況下，盡可能減少分取體積，同時采用最高效的正己烷除脂凈化方法，達(dá)到高效、高性價比的測量喹烯酮的目的， 同時降低樣品基質(zhì)對儀器的影響。 故本實(shí)驗(yàn)確定分取體積為1.0 mL。

2.5 正己烷加入量的確定 喹烯酮屬于弱極性化合物，加入正己烷后響應(yīng)會降低約20%。 本研究通過加入1、2 mL 和3 mL 的正己烷除脂凈化，上機(jī)測定回收率來選擇適合的正己烷加入量，回收率情況見表6。 結(jié)果表明，正己烷的加入量對回收率影響很小。雖然喹烯酮會部分溶解在正己烷，造成含量的丟失， 但同時正己烷也能凈化飼料樣品中其他脂溶性物質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，增加喹烯酮檢測的靈敏度。 綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用3 mL 正己烷除脂凈化。

表6 不同體積正己烷除脂凈化后喹烯酮的回收率（n=3）

為了保證結(jié)果的可靠性， 本研究同時做了3個梯度的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果見表7。 回收率數(shù)據(jù)表明，3 mL 正己烷除脂凈化既能滿足實(shí)驗(yàn)結(jié)果的要求，也能達(dá)到降低基質(zhì)響應(yīng)的目的。

表7 正己烷除脂凈化后不同加標(biāo)濃度的喹烯酮回收率（n=3）

2.6 復(fù)溶渦旋振蕩時間的確定 喹烯酮的檢測屬于反相液相色譜分離，洗脫梯度程序遵循從低比例的有機(jī)相到高比例有機(jī)相的變化。為了保證色譜峰的峰形正常，一般采用與初始流動相比例一致的復(fù)溶液。 喹烯酮屬于弱極性化合物，在高比例的水相中溶解度不高，因此復(fù)溶渦旋振蕩的時間非常重要。本研究采用渦旋振蕩后加入3 mL正己烷除脂凈化，過濾膜后上機(jī)測定。 渦旋振蕩時間分別為10 s 和20 s，不同飼料類別、不同加標(biāo)量的喹稀酮加標(biāo)回收率結(jié)果見表8。 結(jié)果表明，10 s 渦旋振蕩時間后上機(jī)測定的喹烯酮回收率在所有的樣品中偏低， 且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大，無法滿足方法性能參數(shù)的要求。20 s 渦旋振蕩時間后上機(jī)測定的喹烯酮回收率為89.6% ～116.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.44% ～7.19%，結(jié)果重復(fù)性、穩(wěn)定性好、可信度高。

表8 喹烯酮在4 種飼料中的回收率（n=6）

2.7 線性范圍和回歸方程 按照1.2.2 的操作制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在儀器最佳工作條件下，對基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。 4 種飼料的喹烯酮線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)見表9。

表9 喹烯酮的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.8 檢出限、定量限和回收率 在空白樣品基質(zhì)中加入喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液， 用以上優(yōu)化確定的條件進(jìn)行樣品提取、樣液凈化、上機(jī)測定后，再通過信噪比計(jì)算得出喹烯酮的檢出限為6.0 μg/kg、定量限為20.0 μg/kg。空白基質(zhì)中添加量為20.0 μg/kg的喹烯酮特征離子色譜圖見圖2。

圖2 空白基質(zhì)中添加量為20.0 μg/kg 的喹烯酮特征離子色譜圖

根據(jù)確定的檢測條件和定量限， 選擇豬配合飼料、豬濃縮飼料、肉牛精料補(bǔ)充料及豬復(fù)合添加劑預(yù)混合飼料作為樣品基質(zhì)，每6 個樣品為1 組，分別添加1 倍定量限、2 倍定量和10 倍定量限標(biāo)準(zhǔn)溶液，完成喹烯酮的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。

結(jié)果表明， 在41.832 ～418.32 ng 加標(biāo)水平下，豬配合飼料中喹烯酮的平均回收率為102.1%～116.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.89% ～6.35%；豬濃縮飼料中喹烯酮的平均回收率為92.1% ～102.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.79% ～7.19%； 肉牛精料補(bǔ)充料中喹烯酮的平均回收率為95.4% ～99.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.44% ～4.12%； 符合豬復(fù)合添加劑預(yù)混合飼料中喹烯酮的平均回收率為89.6% ～98.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11% ～4.84%。 檢測結(jié)果靈敏度和穩(wěn)定度好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過在樣品中加入乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）分2 次超聲提取，準(zhǔn)確分取1.0 mL 提取液氮吹，復(fù)溶后加入正己烷除脂凈化，過濾膜后上機(jī)測定喹烯酮含量的操作， 建立了飼料中喹烯酮的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。 通過對樣品前處理?xiàng)l件和儀器性能條件的優(yōu)化， 方法的檢出限為6.0 μg/kg、定量限為20.0 μg/kg，4 種飼料喹烯酮回收率為89.6% ～116.0%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.44% ～7.19%。 該檢測方法操作簡單、快捷，檢測結(jié)果靈敏、穩(wěn)定，可滿足飼料中喹烯酮?dú)埩袅康臋z測需求。