基于機器學習算法的鐵死亡相關基因膿毒癥診斷模型

韓冰,趙穎穎,馬銘玉,王巖,杜佳欣,杜麗娟,孫同文

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 綜合ICU,河南 鄭州 450000)

膿毒癥是人體對各種感染反應失調后出現(xiàn)的危及生命的器官功能障礙,是急危重癥醫(yī)學面臨的重要臨床問題,其病死率高達25%,即使存活的患者中仍有約23%出現(xiàn)認知障礙[1-3]。因此,早期識別并及時治療對膿毒癥患者預后改善尤為重要,但目前C反應蛋白、降鈣素原及白介素-6等對膿毒癥的識別仍缺乏特異性[4]。鐵死亡是一種與氧化應激反應和胱氨酸代謝密切相關的脂質活性氧積累驅動的鐵依賴的細胞死亡形式,在形態(tài)學、生物學及基因水平上不同于凋亡、自噬等其他形式的調節(jié)性細胞壞死[5]。研究表明鐵死亡在細胞代謝、氧化還原狀態(tài)以及退行性疾病、癌癥等方面發(fā)揮重要作用[6],但鐵死亡在膿毒癥方面的研究尚有限。本研究利用生物信息學分析膿毒癥患者鐵死亡相關基因并構建診斷模型,為早期識別和治療膿毒癥提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源

本研究從基因表達綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數據庫獲取含有膿毒癥患者和健康人外周血微陣列芯片數據的GSE65682、GSE28750和GSE95233數據集;其中GSE65682數據集中含有480例膿毒癥患者和41例健康人;GSE28750數據集中含有10例膿毒癥患者和20例健康人;GSE95233數據集中含有51例膿毒癥患者和22例健康人。

1.2 數據集處理及鐵死亡基因差異表達分析

利用R軟件(版本4.1.2)通過穩(wěn)健多陣列平均算法對GSE65682、GSE28750和GSE95233數據集進行預處理和歸一化。使用R中l(wèi)imma包對歸一化后的GSE65682數據集中的膿毒癥患者和健康人進行鐵死亡相關基因差異表達分析,以P<0.05和|logFC|>1作為篩選差異基因的閾值,其中l(wèi)ogFC>1為上調基因,<-1為下調基因。

1.3 機器學習算法

支持向量機遞歸特征消除(support vector machine recursive feature elimination,SVM-RFE)是一種強大的特征選擇算法,它結合了支持向量機分類和遞歸特征消除,其工作原理是迭代地從輸入數據集中刪除信息最少的特征,直至達到所需的特征數量。最小絕對收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,Lasso)回歸是一種線性回歸方法,它將L1正則化應用于回歸系數,產生稀疏模型并有助于避免過度擬合。本研究首先利用SVM-RFE算法選取了可以有效識別膿毒癥的鐵死亡基因,然后通過Lasso回歸進一步減少特征數量并提高預測模型的準確性。

1.4 診斷模型構建及評估

根據Lasso回歸系數構建膿毒癥診斷模型,使用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線和曲線下面積(area under the curve,AUC)評估該模型的性能;并用GSE28750和GSE95233數據集對模型進行驗證。

1.5 差異基因功能和通路富集分析

通過CIBERSORT分析免疫細胞與納入預測模型中的鐵死亡基因的關系;根據Lasso回歸構建預測模型計算風險評分,并根據中位數分為高低組,通過R中clusterProfiler包分別進行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)和基因集變異分析(gene set variation analysis,GSVA)。利用Kaplan-Meier曲線分析模型中鐵死亡基因在數據集GSE65682膿毒癥患者中的預后價值。

1.6 統(tǒng)計學分析

本研究所有數據處理與分析均通過R軟件(版本4.1.2)完成,兩組連續(xù)性變量間的比較則使用Wilcoxon秩和檢驗,并通過獨立t檢驗估計正態(tài)分布變量的統(tǒng)計顯著性。生存分析基于R包survival,Lasso回歸分析基于R包glmnet,Kaplan-Meier生存曲線和對數秩檢驗(log-rank test)用于評估生存差異。Spearman相關性分析用于計算不同分子之間的相關系數。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥患者鐵死亡相關基因差異表達分析

通過分析GSE65682數據集中41例正常人和480例膿毒癥患者中306個鐵死亡相關基因,鑒定出34個差異表達基因(differentially expressed gene,DEG),其中19個高表達,15個低表達(圖1A和1B)。進一步分析DEG之間的相關性,結果表明34個DEG相互之間高度相關(圖1C);同時網絡分析結果表明膿毒癥與多個鐵死亡基因變化相關(圖1D)。

A火山圖顯示膿毒癥中306個鐵死亡相關基因,其中下調基因15個,上調基因19個;B熱圖顯示膿毒癥患者中差異表達的鐵死亡基因聚類情況;C膿毒癥患者中鐵死亡DEG之間存在高度相關性;D網絡圖顯示鐵死亡基因在膿毒癥中存在多種基因變化,其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 基于機器學習構建膿毒癥診斷模型

為構建鐵死亡相關基因集識別膿毒癥的模型,本研究首先利用SVM-RFE確定34個DEG中錯誤率最低的前8個基因,FXN、KLF2、LCN2、NR1D2、PGD、TRIB2、TXN和MTF1(圖2A和圖2B);然后應用Lasso回歸算法對這8個基因進行進一步分析,最終明確了一組具有非零系數的7個基因,FXN、KLF2、LCN2、NR1D2、PGD、TRIB2和TXN(圖2C和2D),且相互之間存在高度相關性(圖2F)。根據機器學習算法獲得這7個基因的系數(圖2E)構建診斷預測模型。該模型可有效診斷膿毒癥,AUC為1,比單個基因識別膿毒癥的能力更高(圖3A和圖3B)。進一步分析表明KLF2、NR1D2、FXN、TRIB2在膿毒癥患者中低表達,而LCN2、PGD、TXN則高表達(圖3C),Lasso預測模型評分中膿毒癥患者得分高于正常人(圖3D),P<0.05。

A和B顯示SVM-RFE篩選錯誤率最低的前8個基因;C和D顯示Lasso回歸最終明確了一組具有非零系數的7個基因;E顯示納入模型的7個基因的風險系數;F顯示納入模型的7個基因之間存在高度相關性。

A和B顯示模型在數據集GSE65682中可以有效診斷膿毒癥,AUC=1,比單個基因診斷效能更高;C和D顯示納入模型的7個基因和模型評分在數據集GSE65682中膿毒癥患者和健康人中的表達情況,****P<0.000 1。

2.3 模型驗證

為了進一步驗證預測模型的性能,本研究將該模型應用于GEO的另外2個獨立的數據集(GSE95233和 GSE28750),ROC曲線顯示AUC分別為0.82和1(圖4A和4C);且膿毒癥患者中Lasso預測模型評分高于正常人(圖4B和圖4D)。

A和C顯示模型在GSE95233和GSE28750中可以有效診斷膿毒癥,AUC分別為0.82和1;B和D在GSE95233和GSE28750數據集中模型評分膿毒癥高于正常人,****P<0.000 1。

2.4 7個基因的生物學功能及預后價值

本研究進一步分析7個基因在膿毒癥患者中與免疫細胞相關性,結果表明其與嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、漿細胞等免疫細胞相關(圖5A);同時GSEA分析表明其多與抗原處理和呈遞及自身免疫性疾病等通路相關(圖5B);GSVA分析表明其多與自身免疫性疾病及代謝性通路等相關(圖5C)。為了解7個基因在膿毒癥患者中的預后價值,分析GSE65682數據集7個基因的生存曲線,結果表明高表達KLF2、NR1D2、FXN和TRIB2的患者預后差,高表達LCN2的患者預后較好(圖5D),P<0.05。

A顯示納入模型的7個基因與免疫亞群細胞相關性分析;B顯示在數據集GSE65682中膿毒癥患者的GSEA分析;C顯示在數據集GSE65682中膿毒癥患者的GSVA分析;D為在數據集GSE65682中膿毒癥患者7個基因的生存曲線。

3 討論

膿毒癥是感染后引起的一種急危重癥,早期診斷和及時干預可有效降低膿毒癥的病死率[4,7-8]。然而,由于膿毒癥患者感染的病原微生物多種多樣、個體存在差異、缺乏特異性的臨床特征等原因,膿毒癥的早期診斷和預后預測仍存在困難。本研究利用生物信息學分析GEO數據庫中膿毒癥和正常人的鐵死亡DEG 34個,進一步利用機器學習SVM-RFE和Lasso回歸算法篩選7個基因構建診斷模型,并通過ROC曲線評估模型的性能;最后分析模型中鐵死亡基因的生物學功能及對膿毒癥患者的預后價值。

膿毒癥主要因病原體及機體之間異常免疫反應失衡后細胞線粒體功能障礙、誘導細胞死亡及器官微循環(huán)障礙等機制引起[9-10]。鐵死亡則是細胞內脂質氧化物代謝障礙后依賴鐵離子而發(fā)生的一種程序性細胞死亡;細胞發(fā)生鐵死亡后會釋放大量免疫原性物質,增加炎癥反應加重細胞死亡,進而誘發(fā)多器官衰竭[11]。本研究分析膿毒癥患者和正常人之間鐵死亡基因差異表達,結果表明在膿毒癥患者中有19個基因高表達和15個基因低表達,提示鐵死亡可能在膿毒癥患者的疾病進程中發(fā)揮重要作用。

目前臨床上主要通過生物標志物如C反應蛋白、降鈣素原等結合傳統(tǒng)評分模型如全身炎癥反應綜合征標準、快速序貫器官衰竭評分、改良早期預警評分等來預測和診斷膿毒癥,但這些方法缺乏特異性和時效性,不能及時診斷膿毒癥[4,12]。機器學習是目前醫(yī)學上最常用的分析龐大數據的新型統(tǒng)計學方法,包括決策樹、SVM-RFE及深度學習等,可通過篩選臨床特征和測序數據進而構建預測模型[12]。Desautels等[13]通過機器學習算法利用重癥監(jiān)護醫(yī)學信息數據庫MIMIC-Ⅲ中膿毒癥患者的心率、血壓、體溫、格拉斯哥昏迷評分和年齡等建立了預測模型,AUC高達0.88,高于傳統(tǒng)的評分模型。本研究利用GEO數據庫中膿毒癥和正常人外周血芯片測序數據,結合機器學習算法SVM-RFE和Lasso回歸算法最終篩選出鐵死亡基因FXN、KLF2、LCN2、NR1D2、PGD、TRIB2和TXN構建模型,其在數據集GSE65682、GSE28750和GSE95233中ROC的AUC分別為1、1和0.82;表明該模型可有效識別膿毒癥,為膿毒癥的早期診斷提供了新思路。

LCN2是一種固有免疫蛋白,其在鐵穩(wěn)態(tài)、感染和炎癥中的作用已被廣泛研究[14]。Huang等[15]在細菌內毒素誘導的膿毒癥心力衰竭小鼠模型中發(fā)現(xiàn)心肌組織的LCN2表達量上調,而LCN2缺陷小鼠的心臟損傷較輕,且體外細胞實驗證實外源性LCN2可通過增加不穩(wěn)定鐵池促進心肌細胞H9C2鐵死亡。Srinivasan等[16]研究表明在膿毒癥中LCN2可通過鐵介導的氧化應激調控宿主促炎細胞因子的表達。KLF2是一種髓樣細胞促炎激活的負向調節(jié)因子,是體內先天免疫反應的關鍵決定因素,在患有急性或慢性炎癥性疾病的人群中KLF2表達水平降低30%至50%[17]。研究表明膿毒癥患者中KLF2的表達也降低[18],且與膿毒癥相關急性腎損傷相關[19]。NR1D2是一種配體激活轉錄因子,屬于孤兒核激素受體超家族成員,可參與機體代謝、炎癥反應、生物節(jié)律及自噬等過程[20]。Lachmann等[21]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥休克患者中NR1D2表達降低。PGD即磷酸葡萄糖脫氫酶,參與磷酸戊糖途徑,調節(jié)機體能量代謝[22]。近期研究表明在肺腺癌中PGD的表達與腫瘤突變負荷呈正相關,且可通過鐵死亡調控免疫應答[23]。TRIB2是一種假激酶,其主要功能是作為分子適配器調控蛋白的泛素化,在肝癌和銀屑病中可通過鐵死亡影響疾病的進程[24-25]。TXN即硫氧還原蛋白,可作為細胞因子減輕炎癥反應,在無菌性炎癥中抑制組織損傷中的鐵死亡[26]。在膿毒性腦病的小鼠模型中TXN表達上調,且減輕焦亡相關蛋白及炎癥因子[27]。FXN是一種線粒體蛋白,可以調節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)和線粒體功能,是鐵死亡的關鍵調節(jié)因子,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[28]。由此可見納入模型的7個基因都直接或間接參與鐵死亡,并在腫瘤、炎癥及膿毒癥中發(fā)揮作用。

免疫反應失調是膿毒癥重要發(fā)病機制之一,膿毒癥患者的免疫狀態(tài)可能是影響預后的重要因素[29]。本研究分析模型中基因與免疫細胞的相關性,結果表明模型中的基因與嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、漿細胞等免疫細胞高度相關,同時進一步對模型中的基因進行GSEA和GVSA分析,結果表明其主要富集在免疫和代謝等通路,提示膿毒癥患者中免疫異常,且可能發(fā)生鐵死亡,進而影響疾病進程。對模型中的基因進行生存分析,結果表明高表達KLF2、NR1D2、FXN和TRIB2的患者預后差,高表達LCN2的患者預后較好,這進一步說明納入模型的基因具有較好的臨床預測價值。但本研究仍有一定局限性,一是本研究僅利用GEO數據庫中的數據進行分析,缺乏臨床驗證;二是GEO數據庫的數據缺少臨床資料信息如心率、血壓等;三是因為數據庫中只有膿毒癥和健康人的數據,為此建立的模型可更好地識別膿毒癥,AUC高達1,但是現(xiàn)實中有多種炎癥反應階段的患者,這對機器學習模型是一個挑戰(zhàn)。下一步將完善本中心膿毒癥患者數據,同時也納入多種全身炎癥性疾病患者,完善膿毒癥預測模型。

4 結論

本研究利用GEO數據庫基于機器學習SVM-RFE和Lasso回歸算法構建膿毒癥診斷模型,可很好地識別膿毒癥患者;且納入模型的基因對膿毒癥患者的預后具有指導意義,為臨床上早期識別和及時治療膿毒癥提供理論基礎。