亞低溫治療對豬心臟驟停體外心肺復蘇后凝血功能及炎性因子的影響

王晉祥　續國武　靳衡　賀斌　柴艷芬

摘要：目的 探討亞低溫治療對豬心臟驟停（CA）體外心肺復蘇（ECPR）后凝血功能及炎性因子的影響。方法 采用隨機數字表法將12只巴馬香豬分為對照組、常溫組和亞低溫組，每組4只。常溫組和亞低溫組經右心室誘顫建立CA模型，隨后采用體外膜肺氧合（ECMO）進行ECPR，常溫組目標體溫37 ℃，亞低溫組目標體溫34 ℃，對照組僅進行造模常規置管。24 h后處死動物，取靜脈血檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）及D-二聚體（D-D）水平。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的表達水平。結果 常溫組和亞低溫組PT、APTT、TT、FIB、D-D、TNF-α及IL-6表達水平均高于對照組，亞低溫組各指標低于常溫組（P＜0.05）。結論 亞低溫治療可顯著改善豬CA經ECPR后凝血功能，并降低炎性因子表達水平，從而減輕ECPR相關并發癥及炎癥反應的發生。

關鍵詞：亞低溫；心臟驟停；體外心肺復蘇；凝血功能；炎性因子

中圖分類號：R459.7文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230001

Effects of mild hypothermia treatment on coagulation function and inflammatory factors in a swine model after cardiac arrest and extracorporeal cardiopulmonary resuscitation

WANG Jinxiang XU GuowuJIN Heng HE Bin CHAI Yanfen

1 Department of Emergency Medicine， Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052， China; 2 Department of Oncology， the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine

Corresponding Author E-mail： chaiyanfen2012@126.com

Abstract： Objective To investigate effects of mild hypothermia treatment on coagulation function and inflammatory factors in a swine model of extracorporeal cardiopulmonary resuscitation （ECPR） after cardiac arrest （CA）. Methods Using random number table method， twelve Bama pigs were divided into the control group， the normal temperature group and the mild hypothermia group with four pigs in each group. CA model was established by right ventricular fibrillation in the normal temperature group and the mild hypothermia group， and then ECPR was performed by extracorporeal membrane oxygenation （ECMO）. The target temperature of the normal temperature group was 37 ℃， and the mild hypothermia group was 34 ℃. Control group was only given conventional tube placement. Pigs were killed 24 hours later， and venous blood was taken to detect levels of prothrombin time （PT）， activated partial thromboplastin time （APTT）， thrombin time （TT）， fibrinogen （FIB） and D-dimer antigen （D-D）. Expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with the control group， PT， APTT， TT， FIB， D-D and expression levels of TNF-α and IL-6 were significantly increased in the normal temperature group and the mild hypothermia group. Compared with the normal temperature group， the above indicators were decreased significantly in the mild hypothermia group （P＜0.05）. Conclusion Mild hypothermia treatment can significantly improve coagulation function and reduce the release of inflammatory factors in a swine model of ECPR after CA， so as to alleviate the occurrence of ECPR-related complications and inflammatory reactions.

Key words： mild hypothermia;cardiac arrest;extracorporeal cardiopulmonary resuscitation;coagulation function;inflammatory factor

心臟驟停（cardiac arrest，CA）是一個全球性的重大公共衛生問題［1］。研究顯示我國每年因CA死亡的人數高達103萬例［2］。而院外心臟驟停（out-of-hospital cardiac arrest，OHCA）復蘇存活率僅為2%～12%［3］。體外心肺復蘇（ECPR）較傳統心肺復蘇（CPR）能夠有效恢復自主循環（return of spontaneous circulation，ROSC），并將復蘇成功率和出院成活率提升至47%和34.8%［4］。目標體溫管理（targeted temperature management，TTM）是應用物理和（或）化學方法將核心體溫快速降到目標溫度，維持一定時間后緩慢升溫至正常生理體溫的過程［5］。美國心臟協會心肺復蘇和心血管急救指南推薦CPR復蘇成功后應采取亞低溫治療以恢復重要臟器功能，減少嚴重并發癥的發生［6］。目前關于亞低溫治療在CA患者CPR中的應用研究廣泛，且已證實亞低溫可減輕CA患者全身炎癥反應，保護重要臟器功能［7］。而亞低溫在CA患者ECPR中的相關研究較少。另外，亞低溫對凝血功能的影響尚存爭議，其可通過影響生理凝血過程及其代謝物質緩解或者加重凝血功能障礙［8］。本研究通過探討亞低溫治療對豬心臟驟停體外心肺復蘇后凝血功能及炎性因子的影響，為其臨床應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物和分組 選取健康實驗用普通級巴馬香豬12只，13～15月齡，雄性，體質量35～45 kg，均購自天津市百農實驗動物繁育科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK（津）2020-0002；實驗于天津中醫藥大學實驗動物中心完成，動物使用許可證號：SYXK（津）2020-0005。實驗前禁食24 h，不禁水。采用隨機數字表法將其分為對照組、常溫組和亞低溫組，每組4只。記錄各組動物實驗前體質量、中心體溫、血流動力學參數（心率、平均動脈壓）及呼吸頻率。常溫組和亞低溫組經右心室誘顫建立CA模型，隨后采取ECPR，常溫組控制目標體溫至37 ℃，亞低溫組控制目標體溫至34 ℃；對照組僅進行常規麻醉、氣管插管與CA模型置管，采用控溫毯控制目標體溫至37 ℃。本研究通過天津中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（批準號：TCM-LAEC2022039）。

1.1.2 實驗設備 實驗體外膜肺氧合（ECMO）系統，包括：滾壓式血泵、WEL-1000Wplus熱交換水箱（天津匯康醫用設備有限公司）；膜式氧合器、配套管路及股動脈插管15F、股靜脈插管17F（德國Maquet公司）；心電監護儀、大動物呼吸麻醉一體機、纖維支氣管鏡、除顫儀、心肺復蘇機、手術床、吊塔吊燈、控溫毯（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；便攜式超聲儀（Philips）；高頻電刀及電凝設備（北京索吉瑞）；電子磅秤（上海鼎拓實業有限公司）；外科手術器械。

1.1.3 麻醉及術前準備 實驗豬稱體質量后給予戊巴比妥鈉30 mg/kg肌內注射，誘導麻醉成功后持續泵入丙泊酚4～6 mg/（kg·h）維持麻醉。經纖維支氣管鏡輔助下行氣管插管，呼吸機輔助機械通氣（潮氣量10 mL/kg，頻率15次/min，吸入氧濃度40%）；同時輔以1%～3%異氟烷持續吸入麻醉。連接心電監護儀，將體溫探頭經潤滑后置入肛門5 cm，實時監測體溫變化。床旁超聲引導于一側股動脈置入脈波指示劑連續心輸出量監測（pulse-indicator continuous cardiac output，PiCCO）動脈4F測壓導管，用于實時監測有創血壓變化。給予乳酸鈉林格、5%葡萄糖氯化鈉注射液10～15 mL/（kg·h）交替持續靜脈補液。

1.1.4 ECMO安裝與預充 ECMO由滾壓泵、膜式氧合器及配套管路組成。ECMO管路采用無血預充，預充液采用0.9%無菌生理鹽水。預充完畢后調整為待機狀態。ECMO導管置入：床旁超聲引導下行股動靜脈穿刺置管，動脈插管置管深度10～15 cm，靜脈插管置管深度30～45 cm（以導管尖端達右心房為準）。確認插管位置后用管道鉗夾閉，靜脈推注1 mg/kg肝素鈉注射液預抗凝，妥善縫合固定。

1.2 方法

1.2.1 建立CA模型 床旁超聲引導下經頸內靜脈將雙極起搏電極送入右心室，當電極置入深度18～22 cm時，心電監護儀提示出現室性期前收縮或室性心動過速，提示電極位置抵達右心室心內膜。開始予以電流刺激（9 V直流電），持續3～5 s，參照評估標準［9］［出現室顫心律；收縮壓下降至25 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa）］確認成功誘導室顫致心臟驟停后，停止機械通氣，觀察5～10 min，期間不予任何干預，隨后啟動ECPR搶救流程。

1.2.2 實施ECPR 持續胸外按壓，按壓頻率120次/min，按壓深度為3～4 cm；立即恢復機械通氣（吸入氧濃度100%，潮氣量10 mL/kg，頻率15次/min，）；實施非同步直流電擊除顫（雙向200 J），間斷靜脈注射腎上腺素（0.02 mg/kg）、胺碘酮（2.5 mg/kg）直至心搏恢復，重新建立循環。同時將實驗動物股動靜脈插管分別連接預充好的ECMO管路，ECMO流量調整為20～40 mL/（kg·min），氧流量調整為1.0～1.5 mL/min。維持平均動脈壓>65 mmHg，并適當補充復方氯化鈉、羥乙基淀粉及調整電解質、酸堿平衡。

1.2.3 體溫管理 各組實驗均在25 ℃恒定室溫下進行操作；亞低溫組通過ECMO變溫水箱將目標溫度保持34 ℃；常溫組通過ECMO變溫水箱將目標溫度保持37 ℃；對照組采用控溫毯將目標體溫保持37 ℃；亞低溫組和常溫組動物維持治療24 h后按倫理規定處死，對照組動物繼續進行后續實驗。

1.2.4 標本收集與指標檢測 （1）凝血功能指標。取靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液。采用全自動凝血分析儀（美德太平洋公司），利用光電學原理方法［10］測定凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）及D-二聚體（D-Dimer）水平。（2）炎性因子。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）表達水平。試劑盒購自上海軒澤抗生物有限公司，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗前基礎參數對比 各組動物實驗前體質量、中心體溫、血流動力學參數（心率、平均動脈壓）、呼吸頻率比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。其中常溫組和亞低溫組均成功經右心室誘顫制作CA模型，并成功實施ECPR，復蘇成功率100%。

2.2 各組凝血功能指標比較 與對照組相比，常溫組和亞低溫組PT、APTT、TT、FIB及D-D水平升高（P＜0.05）；與常溫組相比，亞低溫組PT、APTT、TT、FIB及D-D水平降低（P＜0.05），見表2。

2.3 各組炎性因子表達水平比較 與對照組相比，常溫組和亞低溫組TNF-α、IL-6表達水平升高（P＜0.05）；與常溫組相比，亞低溫組TNF-α、IL-6表達水平降低（P＜0.05），見表3。

3 討論

CA是目前臨床最常見的危急重癥之一［11］。美國心臟協會心肺復蘇指南推薦對CA患者行高質量CPR應在早期使用ECMO，稱為ECPR［12］。ECPR治療可將CA患者的ROSC從47%提高至95%［13］。研究證實亞低溫治療在ECPR中發揮保護作用，能夠有效改善復蘇后神經功能和遠期生存率［14］。美國心臟協會和國際復蘇聯合協會（ILCOR）聯合推薦目標溫度為32～36 ℃，達到目標溫度后TTM保持24 h，可改善ECPR預后［15］。目前針對行ECPR的患者給予亞低溫治療的具體方式尚未明確。在CHEER研究［16］中，快速經靜脈給予30 mL/kg冰鹽水誘導體內低溫，34 ℃維持24 h，結果顯示，96%的患者達到ROSC，54%的患者神經功能完好出院。有研究提出采用體外膜肺的控溫系統進行體溫管理，易于監控和調節，并能達到可靠穩定的降溫目標［17］。本研究采用ECMO的變溫水箱進行亞低溫治療，將目標體溫設為34 ℃，達到指定溫度后持續治療24 h，可有效實現TTM。

CA患者經ECPR后，機體重要臟器在經歷快速完全缺血后遭受缺血-再灌注損傷，涉及全身凝血、纖溶系統的紊亂，以及炎癥反應、氧化應激等多種機制［18］。而固有免疫、炎癥反應及凝血反應三者之間存在緊密聯系［19］。機體受創后，血管內細胞發生的免疫反應會觸發特異性凝血通路，使機體從高凝繼發低凝性凝血功能障礙［20］。Mezger等［21］研究發現，亞低溫對凝血功能的影響是雙面的，不同的治療深度和持續時間可能改善或加重凝血功能障礙。Kim等［22］研究表明，輕度低溫（34～36 ℃）對應激狀態下的凝血功能具有改善作用，但體溫過低會抑制纖溶酶原激活物，導致血小板功能障礙，波及凝血酶動力學，進而造成凝血功能障礙。本研究中常溫組和亞低溫組PT、APTT、TT、FIB及D-D水平均較對照組升高，提示CA經ECPR后出現凝血、纖溶系統的紊亂，導致凝血功能障礙；亞低溫組凝血功能指標較常溫組降低，提示通過亞低溫治療后可改善凝血功能障礙，其可能與合理把控亞低溫治療深度、持續時間和有效保護的時間治療窗有關。

CA后會引發多種炎性因子的過度釋放，通過多種機制引起細胞損傷和凋亡。TNF-α不僅可激活炎癥反應，還可誘導細胞因子、炎性介質的釋放，進而激活炎癥級聯反應［23］；IL-6是一種T細胞活化免疫調節因子，參與體內炎癥反應及免疫應答過程，其升高幅度與ECPR后機體炎癥反應程度有關［24］。有研究表明，亞低溫治療能降低CA經ECPR成功后患者血清TNF-α、IL-6水平，改善患者預后［25］。本研究發現，常溫組和亞低溫組TNF-α、IL-6表達水平較對照組升高，提示實驗動物CA經ECPR后機體釋放大量炎性因子；亞低溫組炎性因子表達水平較常溫組降低，與楊小紅等［26］研究結果一致，提示亞低溫治療可減少實驗動物CA經ECPR后炎性介質和細胞因子的釋放，從而減輕缺血-再灌注損傷誘發的全身炎癥反應。

綜上所述，亞低溫治療可有效改善豬CA經ECPR后的凝血功能，降低炎性因子表達水平，從而減輕炎癥反應，這一發現可為CA經ECPR后的臨床治療提供參考。

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（2023-01-05收稿 2023-04-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）